背景温热疗法是在超过人体正常体温的温度下治疗疾病的方法,针对疾病的类别不同,治疗的温度范围通常为40-44°C,持续时间为30-60分钟。此方法以往多用于肿瘤患者的辅助治疗。近年来,本团队已使用具有自主知识产权的红外热疗设备（patentNo:ZL 2007 2 0185403.3）在临床上成功治疗人乳头瘤病毒感染性皮肤病,如寻常疣、生殖器疣（也称尖锐湿疣）、疣状表皮发育不良等,取得了较好的疗效,使病毒疣的临床治愈率提升约10个百分点,且复发率下降。然而,对一些患者如未观察到任何治疗反应,则往往完全没有疗效,目前观察到的临床有效率约为50%-60%,故仍需深入探究温热疗法发挥作用的分子机制,寻找有效的体外干预分子,增强温热治疗效果,缩短疗程,提高有效率和治愈率。热休克蛋白40家族（HSP40s）是一组急性时相反应蛋白,分子量约为40kDa。其最基本的生物学功能是协助热休克蛋白70（HSP70s）的ATP水解酶活性,发挥辅助性分子伴侣的作用。本课题组前期数据显示HSP40s家族成员DNAJA4在温热干预过程中高表达于正常人包皮组织、尖锐湿疣组织及人皮肤表皮角质形成细胞（HaCaT）,并发现DNAJA4缺陷的HaCaT细胞在温热刺激下NF-κB通路活性升高比野生型HaCaT细胞更加明显。NF-κB通路的激活可以上调一系列具有抗病毒活性的细胞因子的表达,如TNF-α及IL-1β,提示DNAJA4与温热诱导抗HPV感染密切相关。此外,经蛋白质组学分析发现,温热还可以导致HaCaT细胞中一系列其他分子的表达水平发生变化,如Clusterin（CLU）、DUSP1（MKP）、HERPUD1、TRIB1、MYC、BCL3等。使用实时荧光定量PCR验证上述分子在温热刺激下的mRNA表达变化,发现大多数结果与蛋白组学变化一致。其中,温热诱导CLU表达似乎受到DNAJA4的影响,因此CLU成为下一步研究中重点关注的分子。丛生蛋白（Clusterin,CLU）是一种普遍存在的多功能糖蛋白,其分子量约为75–80 kDa,广泛表达于各种生物体的体液、组织及细胞中。研究发现,根据分布位置的不同,CLU可分为两型,即分泌型及细胞内型,具有多种生物学功能,包括:增殖调节,免疫调节,组织修复,脂质转运,精子成熟和程序性细胞死亡等。CLU mRNA及蛋白表达水平的上调已经在多种病理生理学改变中被发现,如炎症、肿瘤、组织修复及损伤等。以往的研究已经发现温热可以诱导兔睾丸细胞、人前列腺癌、膀胱癌、上皮癌细胞中CLU表达升高,而且均发挥抗细胞凋亡作用。而温热对人类正常及HPV感染角质形成细胞中CLU表达的影响及相关生物学效应尚未见报道。丝裂原激活蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）信号转导系统在各种真核生物体内普遍存在。当前,依据序列的同源性差异和功能性差异,已经鉴定出的MAPK信号通路至少有4条:（1）细胞外信号调节激酶1/2（extracellular signal regulated kinase,ERK1/2）通路;（2）c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase,JNK）,又称应激活化蛋白激酶通路;（3）p38丝裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen activated protein kinase,p38 MAPK）通路;（4）细胞外信号调节激酶5（extracellular regulated kinase 5,ERK5）通路。近年来,MAPK信号通路在温热中所发挥的生物学作用已经受到越来越多的关注。研究发现,温热刺激可以改变人类角质形成细胞中MAPK信号通路的活性。不仅如此,MAPK通路在病毒复制过程中也起着关键的调控作用,表明温热可能通过该通路在HPV感染性皮肤病的治疗中发挥作用。此外,大量的研究结果已经证实,温热还可以在多种其他细胞中导致MAPK信号通路的活性发生变化,并进一步对细胞的炎症因子表达、增殖、凋亡等生物学效应产生影响。然而,关于温热对MAPK通路的影响及后续生物学效应的研究结果并不完全一致,这些差异很可能与实验细胞或组织的种类、热刺激时的温度及持续时间、热处理后相关指标检测时间点的不同有关。本课题中关键分子CLU与MAPK信号通路之间也存在相互调控关系,以往的研究发现在胰腺癌细胞及星形胶质细胞中,CLU对ERK通路存在正向调控作用,提示温热可能通过CLU影响ERK通路的活性,从而调节细胞增殖、周期、凋亡等生物学效应。了解DNAJA4/CLU/MAPK信号通路在热刺激中所发挥的作用及各分子/通路间的相互作用关系有助于解释临床上温热治疗起效的分子机制,并为后续基础研究及体外干预药物的开发提供有力线索。材料与方法一、实验对象实验用细胞系为永生化人角质形成细胞系（HaCaT）。人类包皮及尖锐湿疣组织来源于2017年11月至2020年1月于中国医科大学附属第一医院皮肤科及泌尿外科门诊诊断尖锐湿疣及包皮过长的患者。经本人或其监护人知情同意。将包皮环切或病理活检术后剩余或废弃的人体组织用于体外温热研究。该研究获得中国医科大学附属第一医院伦理委员会的批准,并符合赫尔辛基宣言。二、温热处理方案体外温热:将新鲜包皮或尖锐湿疣组织等分,组织的真皮侧浸入培养基内,将培养皿底部置入恒温水浴锅内,调节水浴温度,对照组和实验组分别给予37℃和44℃温热处理30分钟,结束后将培养皿放回培养箱,37℃下培养。细胞温热:细胞铺板24小时后,采用水浴加热的方式温热30分钟,方法同体外加热,37℃为对照组,44℃为实验组。结束后将培养皿放回培养箱,37℃下培养。三、免疫组化检测相关蛋白将组织蜡块制备成4μm切片,使用免疫组织化学染色技术检测组织中CLU和p-ERK的表达水平。切片经过脱蜡、修复抗原、一抗及二抗孵育、显色、复染等实验操作流程。显微镜观察并在20倍物镜下拍照。四、实时荧光定量PCR测定温热处理后CLU分子的表达水平变化使用实时荧光定量PCR方法检测CLU分子的mRNA表达水平。总RNA的提取使用Qiagen试剂盒;使用PrimeScript RT regagent Kit（Takara）试剂盒将提取的RNA反转录合成cDNA;实时荧光定量PCR使用SYBR Premis Ex Taq（Takara）试剂盒进行染色和扩增。获得CT值后进行相对定量分析。五、Western blot检测CLU和MAPK信号通路的表达采用Western blot检测温热前后CLU分子和MAPK信号通路的表达水平变化。使用RIPA裂解液裂解并提取细胞或组织中的总蛋白;BCA法检测蛋白浓度;经蛋白变性、凝胶电泳、转膜、封闭液封闭、一抗及二抗孵育、ECL显色,观察并分析蛋白表达水平变化。六、使用RNAi技术,以慢病毒为载体构建CLU基因缺陷的HaCaT细胞采用RNAi技术,以慢病毒为载体敲除HaCaT细胞中的CLU基因,使用荧光显微镜观察转染细胞内的绿色荧光表达,实时荧光定量PCR、western blot技术对基因敲除细胞进行敲除验证。七、抑制ERK通路活性将ERK通路磷酸化抑制剂PD98059（Sigma Aldrich,USA）溶于DMSO并加入培养基中,达到最终浓度5μM或10μM。抑制剂阴性组用等量DMSO处理。PD98059或DMSO预处理在热疗前2小时进行。八、流式细胞术检测CLU及ERK通路对细胞周期和凋亡的影响将慢病毒转染或抑制剂处理后的HaCaT细胞接种于六孔板中,44℃温热处理30分钟,温热处理结束24小时后使用APC Annexin V凋亡试剂盒和PI试剂分别对细胞凋亡比例和细胞周期分布进行检测。九、统计学分析使用SPSS 16.0软件对原始数据进行统计学分析,使用GraphPad Prism软件进行相关图表的制作。组间比较使用配对t检验或方差分析。P<0.05时认为差异有统计学意义。结果1、温热对人类正常及HPV感染角质形成细胞中CLU分子及MAPK信号通路表达的影响在人角质形成细胞、包皮组织、CA组织中,44℃温热刺激可诱导CLU分子表达上调。在人角质形成细胞中,44℃温热刺激对JNK、ERK、p-38的总体表达无显著影响,可诱导JNK、ERK磷酸化水平上调,p-38磷酸化水平下调。在CA组织中,44℃温热刺激可诱导ERK磷酸化水平上调。2、温热诱导HaCaT细胞中表达上调的DNAJA4、CLU分子及p-ERK之间的相互调控关系在人角质形成细胞中,44℃温热刺激下表达上调的DNAJA4可抑制CLU及pERK的表达。44℃温热刺激下表达上调的CLU可抑制p-ERK的表达。DNAJA4与CLU双基因敲除相比单基因敲除可更进一步诱导p-ERK表达上调。3、温热诱导表达上调的CLU及p-ERK对角质形成细胞增殖及凋亡的影响在人角质形成细胞中,44℃温热刺激下表达上调的CLU和p-ERK分别通过抑制细胞凋亡和维持细胞周期发挥细胞保护作用。CLU敲除诱导表达上调的p-ERK通过维持细胞周期发挥细胞保护作用。结论1、44℃温热刺激可上调人类正常角质形成细胞及HPV感染CA组织中DNAJA4、CLU及p-ERK的表达水平。2、在HaCaT细胞中,44℃温热上调的CLU及p-ERK分别通过抑制细胞凋亡、维持细胞周期发挥细胞保护作用。3、在HaCaT细胞中,DNAJA4、CLU及p-ERK之间存在相互调控关系,抑制1-2种保护性因子可导致其他的保护性因子表达进一步上调,提示三者之间存在“此消彼长”的调控关系,很可能为细胞在应激状态下的保护性反馈调节机制。4、以上研究结果提示:如果可以在温热治疗的过程中尽可能多的抑制这些保护性分子或通路,就有可能达到更快、更强的治疗效果。