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目的:哈钦森-吉尔福德早老综合征(Hutchinson–Gilford Progeria Syndrome,HGPS)是由早老素(progerin)积累引起的,progerin是法尼基化的核纤层蛋白A前体(prelamin A)的一种截短形式,常出现在生理性衰老中。HGPS患者出生时表型正常,但是在一岁时就表现出脱发、生长阻滞、骨骼畸形、骨质疏松和硬皮病。由于HGPS患者心血管系统严重受累,患儿通常在十几岁夭折于心肌梗死或中风。最常见的HGPS是由于LMNA基因的11号外显子上G608G发生同义突变(GGC→GGT),导致前体RNA中一个隐蔽剪切位点的激活,产生了缺失150碱基的mRNA,因此编码的prelamin A蛋白内部缺失了50个氨基酸,被称为progerin。在正常情况下,prelamin A先后经过法尼基化修饰、甲基化修饰,最终被锌金属蛋白酶STE24(zinc metallopeptidase STE24,Zmpste24)剪切掉C末端,释放出成熟的核纤层蛋白A(lamin A),同其它的核纤层蛋白共同定位于内核膜的核浆侧,形成细胞核结构骨架。而在HGPS患者中,progerin先后经过法尼基化修饰、甲基化修饰,结合到内质网膜与核膜汇合处,然而由于缺失了Zmpste24酶切的位点,不能进一步加工成熟为lamin A,导致progerin在核膜上错误累积。随着有丝分裂的进行,核膜骨架会解散并重组,而progerin具有高度破坏性。自噬是细胞通过膜转运机制,将胞浆组分转运至溶酶体,进行大分子降解的细胞生物学行为。在低氧、饥饿、氨基酸缺乏等应激状态下,哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)活性受到抑制,自噬增强,细胞通过自噬降解线粒体和大蛋白等胞浆组分,为细胞生存提供必需的氨基酸和能量;在生理状态下,自噬还可以通过清除衰老的细胞器或错误折叠、受损的蛋白,维系细胞稳态。以往的报道显示,自噬能维持新生小鼠饥饿阶段的生存,参与多器官生物发育过程中细胞分化时重塑及红细胞系发育过程中对于线粒体的清除。自噬缺失导致神经退行性改变,提示自噬对于神经元细胞的存活很关键;破坏造血干细胞中自噬,发现正常的造血干细胞功能丢失、严重的骨髓增生以及数周内的小鼠死亡,显示自噬在维系成年造血干细胞生存中的关键作用。早前对于自噬功能的研究都是基于条件性敲除自噬关键蛋白Atg7、Atg5、LC3等,通过组织特异性破坏自噬来观察动物表型的改变。mTOR在PI3K-Akt-mTOR信号通路中受胰岛素、生长因子调控,同时还可以被氨基酸和腺嘌呤核苷三磷酸(adenosine triphosphate,ATP)激活。mTOR能通过直接调控ULK1–Atg13–FIP200复合体而抑制自噬,在细胞生物学实验中通常采用雷帕霉素(rapamycin,RAPA)处理抑制mTOR的手段,达到激活自噬的目的。HGPS成纤维细胞中发生多种异常,包括异常的细胞核形状和DNA损伤应答缺陷。HGPS中累积的progerin同样也存在于生理性衰老中,通过抑制progerin的产生,可以逆转衰老相关的核畸形,这提示我们研究如何治疗HGPS对于抗生理性衰老有着重大科学意义。本研究中,我们将探索mTOR以及自噬如何参与Zmpste24-/-小鼠的过早衰老,因此,我们提取Zmpste24-/-小鼠的组织,检测prelamin A的累积对mTOR和自噬的影响;构建flag-progerin质粒,体外检测progerin对mTOR和自噬的影响。本研究通过对Zmpste24-/-背景的小鼠进行遗传性降低mTOR表达,检测mTOR对早衰表型的影响。为临床治疗早老症提供科学依据,也为研究mTOR参与生理性衰老的机制提供新视角。研究方法:1、将Zmpste24+/-小鼠分别与mTOR亚效等位基因的小鼠(mTOR△/+)或自噬相关基因7+/-(Atg7+/-)小鼠杂合,再以双杂合Zmpste24+/-mTOR△/+(Zmpste24+/-Atg7+/-)小鼠为亲本,获得同窝子代Zmpste24-/-mTOR+/+(Zmpste24-/-Atg7+/+)小鼠和Zmpste24-/-mTOR△/+(Zmpste24-/-Atg7+/-)小鼠,离乳后,每隔20天统计小鼠死亡情况,通过GraphPad Prism 5软件绘制对照组和实验组小鼠的生存曲线。取新生野生型小鼠与Zmpste24-/-小鼠的心肌、肝、脑组织,通过Western blot检测p-mTOR、total-mTOR表达情况。2、取新生野生型小鼠与Zmpste24-/-小鼠的心肌、肝、脑组织,通过Western blot检测自噬相关指标p62和LC3;从Zmpste24+/-杂合的E12.5?14.5胚胎中建立Zmpste24+/+和Zmpste 24-/-基因型小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblasts,MEFs),Western blot检测自噬相关指标p62和LC3。3、取同窝野生型小鼠、Zmpste24-/-mTOR+/+小鼠和Zmpste24-/-mTOR△/+小鼠的心肌、肝组织,通过Western blot检测自噬水平指标p62、LC3;从Zmpste24+/-杂合的E12.5?14.5胚胎中建立Zmpste 24+/+和Zmpste 24-/-基因型MEFs,分成三组:(1)Zmpste24+/+MEFs、(2)Zmpste 24-/-MEFs、(3)用1μM RAPA处理Zmpste 24-/-MEFs 6h,Western blot检测p-mTOR、total-mTOR、p62和LC3的表达;取同窝野生型小鼠、Zmpste24-/-mTOR+/+小鼠和Zmpste24-/-mTOR△/+小鼠的心肌组织,Western blot检测p-mTOR、total-mTOR、p-S6K1(Thr389)、total-S6K1的表达。4、取新生野生型小鼠与Zmpste24-/-小鼠心肌、肝、脑组织,Western blot检测p-Akt(Thr308)、p-Akt(Ser473)、total-Akt的表达。5、将Zmpste24+/-小鼠与mTOR△/+小鼠杂合,再以双杂合Zmpste24+/-mTOR△/+小鼠为亲本,获得同窝子代Zmpste24-/-mTOR+/+小鼠和Zmpste24-/-mTOR△/+小鼠,离乳后,雌雄分开饲养。统计小鼠死亡情况;对小鼠进行称重并记录;检查后肢肌无力情况并进行统计。通过GraphPad Prism 5绘制对照组和实验组小鼠的生存曲线、体重增长曲线、正常的握力曲线。6、将Zmpste24+/-小鼠分别与mTOR△/+小鼠或Atg7+/-小鼠杂合,通过基因型鉴定,预测并观察Zmpste24+/-mTOR△/+(Zmpste24+/-Atg7+/-)小鼠杂合的后代数量。7、分子克隆法构建pcDNA4.0-flag-progerin真核表达质粒。8、将vector与flag-progerin质粒分别转染细胞,转染48h后,收集细胞,通过Western blot检测p-mTOR、total-mTOR、自噬相关指标p62和LC3表达情况,以及p-Akt(Thr308)、p-Akt(Ser473)、total-Akt的表达。9、将vector与flag-progerin质粒分别转染HEK293T细胞,通过免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,Co-IP)实验,检测progerin与Akt结合情况;体外GST-pull down实验检测progerin与Akt是否直接结合。结果:1、Zmpste24-/-mTOR△/+小鼠的中位生存时间比Zmpste24-/-mTOR+/+群体延长32.8%,而Zmpste24-/-Atg7+/-小鼠与同窝出生Zmpste24-/-Atg7+/+小鼠的中位生存时间几乎没有区别。Zmpste24-/-小鼠的mTOR激活形式和总mTOR均超过了野生型同窝仔鼠。2、与野生型组相比,在Zmpste24-/-小鼠中,通过p62的积累,以及LC3-I向LC3-II的转换受到抑制,观察到基础自噬功能受损;与野生型MEFs相比,Zmpste24-/-MEFs中自噬受到抑制。3、在Zmpste24-/-小鼠中,通过遗传性减少mTOR,部分恢复自噬;RAPA处理Zmpste24-/-MEFs,结果显示,p62水平降低,自噬流的转换增加;由于mTOR降低,过度活化的S6K1活性降低至正常。4、与野生型小鼠相比,Zmpste24-/-突变小鼠的p-Akt(Thr308)、p-Akt(Ser473)表达水平均增加。5、与Zmpste24-/-mTOR+/+组相比,雄性和雌性Zmpste24-/-mTOR△/+小鼠的中位生存时间分别延长了25%和35.6%。mTOR的遗传性降低除了增加Zmpste24-/-小鼠的中位生存期外,还将它们的最大寿命从162天提高到199天,增加了22.8%。体重曲线显示出性别依赖性,遗传性降低mTOR显著增加了雄性HGPS小鼠的体重,而这种体重的增加在雌性组中不会发生。Zmpste24-/-mTOR△/+小鼠比同窝Zmpste24-/-小鼠大。Zmpste24-/-mTOR△/+小鼠握力异常发作时间比Zmpste24-/-mTOR+/+小鼠延迟到61%的程度。6、在Zmpste24-/-的背景下,有79.5%的mTOR△/+小鼠无法在子宫中正常发育,而在Atg7杂合的小鼠中则完全存活。7、成功构建pcDNA4.0-flag-progerin真核表达质粒。8、在HELA和MCF-7细胞系中分别过表达人类progerin,结果均显示mTOR被激活;积累p62并抑制LC3-I向LC3-II的转换;并且,人类progerin激活了Akt。9、Co-IP分析显示了progerin与Akt的相互作用。GST Pull-down检测结果显示progerin不与Akt直接结合。结论:1、利用mTOR亚效等位基因小鼠和Zmpste24-/-早老小鼠进行杂合,通过降低mTOR,增强自噬,显著延长了Zmpste24-/-小鼠寿命。mTOR的遗传性减少会延迟Zmpste24-/-小鼠的过早衰老,但要以频繁的胚胎发育失败为代价。2、prelamin A累积在新生Zmpste24-/-小鼠中诱导mTOR过度激活和自噬受损。3、progerin在体外诱导mTOR过度激活和自噬受损。