肺癌是当今世界上发病率和死亡率最高的恶性肿瘤，且呈逐年上升趋势。目前的综合治疗措施仍是以手术为主，化疗、放疗为辅。由于发现时多为晚期，许多病人已丧失了手术机会，同时化、放疗耐受现象又较严重，预后很差，因此迫切需要寻求新的辅助治疗手段以提高疗效。RNA干扰（RNA interference，RNAi）是十九世纪末发展起来的基因沉默技术。它能触发一种转录后基因监控程序，导致特定mRNA降解，使相应基因表达受到抑制。RNAi具有特异、高效和持久的特点，已被广泛用于肿瘤基因治疗、病毒感染、基因药物筛选等多个研究领域。但与其它基因治疗技术一样，RNAi同样存在目的基因选择的问题。Survivin是结构独特的凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis proteins，IAP）家族成员，在人类常见恶性肿瘤中选择性高表达，而在正常终末分化的成人组织中几乎不表达，不仅能抑制凋亡，而且还能促进细胞增殖，在血管生成中也起重要作用。Survivin表达与肿瘤发生、发展、耐药形成、不良预后等多种肿瘤生物学行为密切相关，抑制其表达和／或功能可触发凋亡，引起细胞分裂缺陷，因此被认为是肿瘤预防和治疗的理想靶点。紫杉醇是近几十年已用于临床的最好的天然抗癌药物之一，目前普遍用于治疗肺癌等多种实体肿瘤，主要作用机制是促进微管聚合，抑制微管解聚。但是由于水溶性差、毒副作用严重以及对多种耐药机制的易感性使得紫杉醇未能得到充分地使用。P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）过表达和微管蛋白基因变化引起紫杉醇耐药的报道已有很多，然而均不能完全解释肿瘤对紫杉醇的获得性耐药现象。最近，survivin过表达与紫杉醇耐药之间的关系日益受到人们关注，但在肺癌中的研究却很少。为此，我们设计这个研究方案，以评估紫杉醇和RNAi沉默survivin基因表达对人肺癌细胞株的生长抑制作用，尤其是survivin在紫杉醇耐药形成中可能的作用以及survivin靶向治疗措施作为肺癌化疗增敏剂的潜在价值，为临床制定联合治疗方案（包括survivin抑制剂）增强肺癌对紫杉醇的化疗敏感性，降低紫杉醇用药剂量，提供合理的实验基础。第一部分紫杉醇对肺癌细胞株的生长抑制作用目的：评价紫杉醇对3种p53基因型肺癌细胞株的生长抑制作用，以及诱导凋亡与G₂／M期阻滞的关系。方法：分别以体外药物敏感试验（MTT法）、流式细胞术、荧光显微镜、Western blot观察紫杉醇不同作用浓度、不同作用时间处理后，A549细胞（p53野生型）、H322细胞（p53突变型）、H1299细胞（p53缺失型）生长抑制情况以及细胞周期、细胞凋亡、乙酰化微管蛋白、p53蛋白等指标的变化。结果：1、紫杉醇对3种肺癌细胞均有明显生长抑制作用，并且这种抑制作用呈现出时间依赖性特点（P＜0.05），紫杉醇对A549、H322、H1299细胞的半数抑制浓度(IC₅₀)，在作用72h时，分别为38.01nmol／L、184.76nmol／L、62.26nmol／L，96h时，分别为9.2nmol／L、29.78nmol／L、37.55nmol／L；同样，不同作用浓度对三株肺癌细胞生长的影响也存在差异（P＜0.05）。2、G₂／M期和凋亡的变化：浓度依赖性试验中，凋亡比例在低浓度范围内（0.1～10nmol／L）呈浓度依赖性特点；紫杉醇浓度≤100nmol／L时，G₂／M期细胞比率随浓度增加而增高（P＜0.05），≥100nmol／L时，G₂／M期阻滞程度无明显差异。时间依赖性试验中，10nmol／L作用时，G₂／M期所占比例在12h以内，与作用时间呈正相关（P＜0.05），随着作用时间进一步延长，阻滞程度反而下降，三株细胞之间的变化趋势基本一致；1000nmol／L作用时，A549细胞G₂／M期比率与作用时间呈正相关（P＜0.05），而H322和H1299细胞G₂／M期阻滞未表现出时间效应，于24h达高峰后，比例开始下降，H1299细胞在作用后期出现异常多倍体现象；凋亡的发生呈时间依赖性，但高浓度（1000nmol／L）诱导凋亡不如低浓度（10nmol／L）出现的早。典型凋亡细胞出现浓缩、成片的染色质。紫杉醇诱导的凋亡和G₂／M期阻滞无相关性（P＞0.05）。3、Western blot结果：A549细胞中野生型p53蛋白水平以浓度依赖和时间依赖的方式增加，H322细胞中突变型p53蛋白的表达无明显变化。3株肺癌细胞中乙酰化微管蛋白的表达在紫杉醇作用后均明显上升。结论：紫杉醇对不同p53基因型肺癌细胞的生长抑制作用均呈时间依赖性，不同作用浓度对三株肺癌细胞生长的影响也存在差异；细胞凋亡和G₂／M期阻滞可能是其作用机制不同的表现，两者可以共存，但无明显相关性；低浓度（10nmol／L）紫杉醇虽然对G₂／M期阻滞影响较小，但却能比高浓度（1000nmol／L）更早诱发凋亡，延长作用时间亦可达到有效抑制肿瘤细胞增殖的目的；紫杉醇可以增加野生型p53蛋白的表达水平，诱导p53依赖和非p53依赖的两种凋亡途径，p53功能状态也影响了高浓度紫杉醇对肺癌细胞的周期阻滞作用，但对紫杉醇的化疗敏感性无显著影响。第二部分Survivin siRNA对肺癌细胞株的生长抑制作用目的：评价survivin siRNA对p53野生型和p53缺失型肺癌细胞株的生长抑制作用。方法：应用RNAi技术，以化学合成的survivin siRNA（小干扰RNA）体外转染肺癌细胞，采用MTT法、流式细胞术、半定量RT-PCR、Western blot分析转染前后肺癌细胞增殖、细胞周期和凋亡、survivin mRNA和蛋白、PARP、p21、p53蛋白等指标的变化。结果：1、A549细胞中survivin表达量明显低于H322与H1299细胞；2、siRNA转染组细胞survivin蛋白及RNA表达水平显著低于对照组（P＜0.01），空白对照组与无关干扰组间无明显差异（P＞0.05）；3、survivin特异性siRNA对A549和H1299细胞的生长抑制作用均呈浓度依赖性（P＜0.05），但H1299细胞起效晚于A549；4、转染后A549和H1299细胞均有G₁期细胞比率增加和S期细胞比率相应的减少，A549有一定比例细胞出现凋亡，H1299凋亡不明显；5、转染后PARP发生了裂解，A549细胞中p53、p21蛋白表达增加。结论：survivin与p53之间可能存在相互抑制的作用，survivin特异性siRNA不仅能明显抑制p53野生型A549细胞的生长，也能有效抑制p53缺失型H1299细胞的增殖，对肺癌治疗具有普遍的临床意义。第三部分Survivin siRNA联合紫杉醇对肺癌细胞株的生长抑制作用目的：探讨survivin表达对紫杉醇耐药可能的影响以及survivin siRNA联合紫杉醇对肺癌细胞株的生长抑制作用。方法：1、紫杉醇不同作用浓度、不同作用时间处理3种肺癌细胞后，采用Western blot、流式细胞术检测分析survivin蛋白、Erk／磷酸化Erk、PARP的表达以及细胞周期和凋亡的变化。2、为检测survivin siRNA对紫杉醇化疗敏感性的影响，将A549细胞分为4组：对照组、survivin siRNA组、紫杉醇组、survivin siRNA+紫杉醇组，分别采用MTT法、Western blot、流式细胞术比较各组间细胞生长趋势、survivin、p21、PARP、p53蛋白以及细胞周期和凋亡变化的差异。结果：1、紫杉醇对survivin表达的诱导与G₂／M期阻滞一样，在作用4h时就已出现，延长处理时间（48h或更长），survivin表达会逐渐减少，两者变化趋势基本一致，并且与p53功能状态无关。3、Erk／磷酸化Erk在肺癌细胞中表达量很高，但在紫杉醇作用机制中的意义可能具有组织和／或细胞株的特异性；4、survivin siRNA可以抑制紫杉醇诱导的survivin表达，survivin siRNA和紫杉醇共同处理A549细胞48h后，对细胞增殖的抑制具有协同或相加的效果，对凋亡的诱导也有轻度相加作用，对细胞周期的影响则表现为G₁期、G₂／M期的增加，S期细胞比率明显的减少，对PARP的裂解和p21、p53蛋白的表达也有促进作用。结论：survivin过表达可能参与了紫杉醇获得性耐药的形成，有丝分裂生存途径至少是肿瘤细胞通过survivin拮抗紫杉醇诱导凋亡的一种方式，siRNA阻抑survivin表达是增加肺癌细胞对紫杉醇化疗敏感性的有效途径。