目的:胃癌(Gastric Cancer)是最常见的消化道恶性肿瘤之一,其致死率在世界范围内位居所有恶性肿瘤的第二位,其中东亚、东欧及美洲中部和南部为胃癌高发区。胃癌在我国也是最常见、同时也是发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一。由于其发病隐匿,临床症状在早期不明显,病人一经发现多处于临床晚期,目前对胃癌的早期发现和诊断缺少有效及敏感的方法,因而进一步了解胃癌的发生、发展及其转移特点对我们早期发现、早期诊断和早期预防胃癌都有重要的作用及意义。胃癌的发生是一个多基因、多因素、多阶段及多途径的复杂过程,涉及到遗传学和表观遗传学方面的改变,已有研究证实,在胃癌的发生发展过程中,表观遗传学改变起到了非常重要的作用。表观遗传学改变是一种未涉及DNA序列变化的基因外调控机制,主要包括DNA甲基化、组蛋白修饰、基因印记、染色体重塑和非编码RNA调控等。其中DNA甲基化是目前人们研究最为深入的一种表观遗传学修饰方式,DNA的甲基化是指在DNA甲基转移酶(DNMTs)的作用下,以S腺苷甲硫氨酸(SAM)作为甲基供体将甲基基团转移到CG二核苷酸序列中胞嘧啶碳原子上的一种化学反应。CG二核苷酸富集的DNA片段称为CpG岛,哺乳动物的CpG岛长约300-3000bp, CpG岛常位于基因转录起始部位或起始部位附近,其中以脊椎动物的管家基因为代表。大连地区具有自身特殊的地理地貌特点和这里的居民有长期形成的饮食习惯。流行病学研究发现大连居民大多喜食烧烤、腌制海鲜及泡菜等,而这类食物中含有大量的亚硝酸盐类及多环芳烃类化合物,其中许多是常见的致甲基化剂如亚硝酸盐、笨并芘。经过长时间的刺激和积累,这些不佳的饮食习惯在很大程度上增加了本地区人群遗传学及表观遗传学变异的几率和罹患胃癌的风险。我们在前期工作中发现了大连地区胃癌COX-2、S100A4、p16、hMLH1、E-cadherin等基因和位点启动子区域存在异常的甲基化,导致相应基因表达下调或缺失。其中部分结果与以往的研究结果相同,部分结果也有不同之处如COX-2基因的甲基化在大连地区胃癌中呈现增高趋势,这一现象提示我们大连地区胃癌的高发机制可能与其他地区胃癌的发生机制不同,大连地区胃癌表观遗传学改变可能与本地区特殊的环境因素及人群遗传背景相关。基于去甲基化剂能使因高甲基化而沉默的基因恢复表达的这一原理,使用去甲基化剂消除人类肿瘤细胞基因组DNA的异常甲基化成为人们近年研究的热点。去甲基化剂如5-azacytidine、5-aza-2’-deoxycytidine和zebularine已被广泛应用于血液疾病临床治疗及多种基础研究中。基因启动子区的高甲基化与基因沉默之间有着非常重要的联系,去甲基化剂同样也被应用于确认肿瘤细胞中沉默的基因是否由表观遗传学修饰所引起的。随着人们对肿瘤表观遗传学认识的深入,去甲基化剂的研究和应用有着光明的应用前景,可能成为肿瘤治疗的重要工具。1999年Toyota等首先在直肠癌多位点甲基化的研究中提出了CIMP(CpG island methylator phenotype)这一概念,来评估肿瘤基因组的整体甲基化状态,2004年Issa等经研究总结出了胃癌的CIMP体系及其评价标准,我们也曾采用此体系检测了大连地区胃癌的CIMP特征,结果表明多位点甲基化与胃癌进展有关,并随着胃癌的演进,甲基化基因的种类增多,基因的甲基化程度增强。个体CIMP型的鉴定对临床肿瘤发病风险预测、预防及预后评估等许多方面均具有重要意义。随着对胃癌研究的不断深入,更多胃癌相关基因不断被发现,可供参考的基因也不断增加,因而我们考虑选用新的敏感基因加入到CIMP体系的候选行列中,试图建立一个适合本地区胃癌早期发现、早期诊断和早期评估的新CIMP体系,为本地区胃癌的预防、预测和早期诊断提供理论指导。我们的研究目的在于通过检测特定区域肿瘤、癌前病变、癌旁相对正常及非癌正常对照胃粘膜组织的表观遗传学改变,判断表观遗传学相关因素在肿瘤发生发展过程中的作用,探讨大连地区胃癌高发的发病机制,为胃癌的临床早期诊断、预防及治疗提供新的理论依据和指导。方法:全部标本来自大连医科大学辽宁省(高校)癌症基因组重点实验室建立的人胃癌组织库。在冰冻组织微阵列技术和定点捕获技术基础上,应用免疫组织化学法、免疫细胞化学法、RT-PCR、Western blotting、细胞培养(加入去甲基化5-aza-dC)及甲基化特异性PCR(MSP)等方法,分别对不同病变胃组织及四个胃癌细胞系中10个敏感甲基化位点进行了分析;并对6个基因的表达及其与该基因启动子甲基化之间关系进行了探讨;在以往的实验基础上还对本地区胃癌CIMP鉴定体系进行初步的摸索和创新。实验数据采用SPSS12.0软件,应用Kruskal-Wallis和Mamm Whitney检验方法进行统计分析。结果:一、10个敏感位点在不同病变胃黏膜组织中的甲基化状态甲基化特异性PCR(MSP)结果显示:在胃镜、癌旁相对正常、癌前病变及胃癌组中,10个位点的甲基化频率均呈现上升趋势,除MINT2和THBS1基因外其余8个基因在正常胃组织中均有不同程度的甲基化,其中hMLH1、TIMP3、RASSF1A、MINT1、MINT2和E-cadherin基因在胃镜组和胃病变组(癌旁相对正常、癌前病变、胃癌)间存在显著统计学差异(p<0.05);hMLH1、TIMP3、RASSF1A、MINT2和E-cadherin基因在胃镜组和癌旁相对正常组间存在显著差别(p<0.05);p16、hMLH1、TIMP3、RASSF1A和MINT2基因在胃癌的发生过程中表现出持续的高甲基化水平。二、10个敏感位点在四个胃癌细胞系中的甲基化状态甲基化特异性PCR结果显示: 10个位点在四个胃癌细胞系(MGC803、BGC823、AGS和HGC-27)中的甲基化状态为:AGS细胞系有两个位点的甲基化(p16和TIMP3);MGC803细胞系有三个位点的甲基化(TIMP3、RASSF1A和MINT1);BGC823细胞系有四个位点的甲基化(TIMP3、RASSF1A、MINT1和MINT2);HGC-27细胞系有5个位点的甲基化(p16、TIMP3、RASSF1A、MINT2和E-cad)。三、甲基化高发位点在胃粘膜组织及四个胃癌细胞系中的表达情况免疫组织/细胞化学结果显示: p16、hMLH1、TIMP3、DKK3和E-cadherin五个基因在不同进展期胃病变中的表达与其甲基化结果基本呈负相关,证实了基因启动子区异常高甲基化使相应基因表达下调或沉默。组织标本(G-102,肠上皮化生)和胃癌细胞系(MGC803、BGC823和HGC-27)中有TIMP3基因甲基化和表达同时存在的情况,可能涉及到该基因部分甲基化或者部分细胞未甲基化及自动去甲基化等原因。四、CIMP体系的建立参照以往研究的结果和本实验室之前对大连地区胃癌CIMP体系的初步探讨加上本实验对大连地区胃癌多基因甲基化与表达的研究,我们尝试采用p16、hMLH1、TIMP3、RASSF1A和MINT2五个指标建立一个更适合本地区胃癌早期诊断和发现的CIMP鉴定体系。结果证实此体系在胃癌发生的早期就表现出很高的灵敏性,有利于我们对易患个体进行胃癌的早期预警、早期预防和早期诊断。五、去甲基化剂5-aza-dC在胃癌细胞系中的应用用去甲基化剂处理MGC803和HGC-27细胞系,结果显示使用去甲基化后,MGC803细胞系中RASSF1A基因在mRNA和蛋白水平恢复了表达,TIMP3基因在mRNA和蛋白水平的表达有所增强;HGC-27细胞系p16、RASSF1A、和E-cadherin基因恢复了mRNA和蛋白水平的表达,TIMP3基因mRNA和蛋白的表达也有所增强。这些结果证实了DNA甲基化是抑癌基因或修复基因等的主要失活因素,因而在胃癌的发生发展中表观遗传学修饰起到了重要的作用。结论:一、表观遗传学改变尤其是DNA的甲基化是胃癌发生发展过程中的重要事件。大连地区胃癌呈现出多位点高甲基化特点,并且随着病变的进展,基因的甲基化程度增强,甲基化位点也增加。与其他地区胃癌的研究结果相比,本地区人群在正常胃组织中有多个基因(p16、hMLH1、TIMP3和RASSF1A等)的甲基化程度较高,这表明大连地区存在甲基化易患性,这些可能与本地区的饮食、环境等因素相关。二、CIMP体系用于评估肿瘤基因组整体甲基化状态,个体CIMP型的鉴定对临床肿瘤发病风险的预测、预防及预后评价有重要作用。我们经研究发现,不同基因在不同地区胃癌中的甲基化状态不同,因而对某个地区胃癌整体甲基化进行评估时应多采用一些甲基化敏感基因,从中选出适合本地区胃癌特点的检测指标进而建立自身的CIMP鉴定体系。基于这样的理念,我们选用p16、hMLH1、TIMP3、RASSF1A和MINT2五个指标建立了一个适合大连地区胃癌早期发现和诊断的CIMP体系。这五个指标在以往的研究中均被证实与胃癌关系密切,但将这五个位点作为综合参考指标评估本地区胃癌CIMP体系尚属首次。三、肿瘤细胞中呈现出基因组整体的低甲基化和局部区域(抑癌基因、修复基因等)的异常高甲基化,启动子区的高甲基化可抑制相应基因的失活,进而导致肿瘤的发生。我们对p16、hMLH1、TIMP3、DKK3和E-cadherin五个基因在胃癌组织及细胞系中表达情况的研究证明,基因的表达与其甲基化状态基本呈负相关,基因的甲基化状态调控并影响着相应基因的表达、表达下调和失活。四、TIMP3基因在胃癌组织及细胞系中可能存在部分甲基化。我们应用免疫细胞化学和RT-PCR法对胃病变组织和胃癌细胞系的检测结果表明TIMP3基因能够同时存在基因的甲基化和表达,这一结果让我们对DNA的甲基化有了新的认识。而TIMP3基因甲基化与否和甲基化的程度可能与胃癌患者的预后有关。五、在胃癌的发生过程中,表观遗传学改变较遗传学改变相比,起到了更为重要的作用,因而我们未来对胃癌的治疗重点也要放到表观遗传学方面。我们用去甲基化剂5-aza-dC处理MGC803和HGC-27两个细胞系,发现许多抑癌基因的失活是由于基因甲基化引起的,因而我们推测不论在胃癌组织还是在胃癌细胞中,抑癌基因表达下调或沉默是相应基因启动子区DNA甲基化的结果。这一发现也为日后胃癌的有效防治提供了一条新路。