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细胞珠蛋白(Cytoglobin,Cygb)是日本科学家在2001年对纤维化的肝脏进行蛋白质组学分析时在大鼠肝星状细胞(Hepaticstellate cells,HSC)中首次发现的一种球蛋白,最早被命名为星状激活蛋白(Stellate Activating Protein,STAP)。Cygb是由190个氨基酸组成、分子量为21.4 KDa的一种细胞内球蛋白,与血红蛋白(HGB)、肌红蛋白(MGB)、脑红蛋白(NGB)一样是携氧球蛋白家族的主要成员,作为机体储存及运输氧的载体,具有末端氧化酶和一氧化氮双加氧酶活性和清除活性氧(reactive oxygen species,ROS)的功能。研究报道Cygb与多种疾病的发生发展相关,如肝脏、肾脏、胰腺等组织器官的纤维化、青光眼、胃管反流以及一些炎症、神经退行性疾病等。Cygb具有多种生物学功能。本实验室前期的研究结果表明Cygb可以显著的逆转大鼠肝纤维化、肺纤维化、脂肪肝及高血脂和动脉粥样硬化等。本研究是在实验室已获得对上述病症治疗效果的基础上,为下一步进行临床前试验提供符合纯度标准的Cygb样品。基于药物蛋白制备原则,重组人源细胞珠蛋白(recombinant human cytoglobin,rhCygb)的制备由 BL21/pET28a(+)-rhCygb重组质粒转化大肠杆菌,以不带标签的包涵体形式表达,主要采用免疫亲和层析、阴离子交换层析、凝胶过滤层析三种方法,得到rhCygb纯化产物后,从体外抗氧化和抗炎症方面研究了 rhCygb的生物活性。本研究共分为四章:第一章是rhCygb的表达制备,rhCygb的制备由BL21/pET28a(+)-rhCygb重组质粒转化大肠杆菌,得到的是不具有生物学活性的包涵体,主要探讨试验不同的洗涤包涵体和复性包涵体的方案,实验结果显示葡聚糖凝胶(Sephadex)G-25柱上复性得到理想的包涵体产物。第二章是免疫亲和层析法纯化rhCygb,首先使用BALB/c小鼠制备抗rhCygb单抗腹水抗体,并采用proteinA纯化单克隆抗体,选出特异性较好及亲和力适中的单抗制备成抗体亲和层析柱来纯化rhCygb,通过质谱鉴定分子量。实验结果显示rhCygb纯化达到粗分离效果,但rhCygb结果产物纯度<90%,用超滤管离心浓缩时有蛋白析出,呈白色絮状,考虑亲和层析洗脱pH条件极端,且抗体和Sepharose4B填料上的氰基易脱落问题。虽然免疫亲和层析纯化蛋白质应用较广,通常作为蛋白质纯化的第一选择,但本次实验亲和层析不适合rhCygb作为药物蛋白的纯化工艺研究。第三章是阴离子交换和凝胶过滤层析纯化rh Cygb,使用强阴离子交换层析,得到纯度为89.34%的rhCygb,进一步使用凝胶过滤层析分离纯化分子量与rhCygb差异较大的少许杂蛋白,使用高效液相色谱计算纯度纯度为92.6336%以及Western blot鉴定免疫活性。实验结果显示阴离子交换结合凝胶过滤层析纯化rhCygb可作为本次蛋白纯化方法。第四章是研究rhCygb抗炎抗氧化的生物活性。通过检测清除1,1-二苯基-2-苦肼基(DPPH)来判定rhCygb的体外抗氧化能力;缺糖缺氧诱导BV2小鼠小胶质细胞,模拟体内细胞炎症模型,经缺糖缺氧恢复并加以rhCygb,检测细胞活力以及ROS含量来判断rhCygb对OGD诱导的BV2小胶质细胞的抗炎症反应。实验结果显示rhCygb具有清除DPPH能力,具有抗氧化活性;rhCygb保护缺糖缺氧诱导激活的小鼠BV2小胶质细胞的活性以及降低了此模型的BV2细胞内的活性氧含量,具有抗炎活性。综合以上结果得出结论:1.建立了 rhCygb的表达和纯化方法。离子交换结合分子筛层析获得了纯度为92.6336%的目标蛋白,为rhCygb药物临床前研究奠定了物质基础。2.初步确定rhCygb具有抗氧化生物学活性以及良好的抗炎作用。