铜绿假单胞菌是一种机会致病菌,在自然界广泛分布,它具有群体感应系统主要包括las、rhl和PQS三类,调控下游如细菌毒素、弹性蛋白酶、生物发光等很多基因转录表达,因此群体感应(Quorum Sensing即QS)基因通路是抗菌药设计的重要靶点。鼠李糖脂(rhamnolipid)受到rhl系统调控,是一种生物表面活性剂,与细菌群集运动(swarming motility)有关,以往研究认为它的两亲性有助于疏水性信号分子在菌体之间的扩散。为了检验C4-HSL和C12-HSL信号分子存在,我们引入PrhlI启动子,可对两种信号分子都做出响应。PrhlI属于弱启动子,因此本文第二章提出了一种新型的双色荧光基因报告子模型,从正向和反向做了信号双重放大,有效提高了信噪比。本文通过外源添加高丝氨酸内酯类信号分子C4-HSL诱导JP2-HJD15B-PrhlI-Tn7菌种,检测到QS信号不均匀开启的现象,推测某种胞外分泌物阻挡信号分子进出。经筛选,当rhlA敲除或者过表达后,细菌对C4-HSL和C12-HSL信号分子摄取具有显著影响,鼠李糖脂在一定程度上可以阻挡信号分子进出细菌。信号分子在生物膜中并非均匀扩散,而是分布在鼠李糖脂形成的“隔间”中,造成局部浓度的不均匀。这使得能产生信号分子的细菌仅仅自我利用,可能是细菌抑制“社交骗子(cheater)”出现的新机制。本文第三、四章主要介绍多色荧光成像定量系统及其在QS系统研究中的应用举例。迄今为止,许多具有不同的光谱特征的荧光蛋白被用于显微镜成像,但多色成像策略仍主要关注怎么尽可能的减少光谱重叠地使用这些荧光蛋白,然而很多荧光蛋白光谱重叠较多因此限制了多色荧光蛋白的同时使用。第三章介绍了一种新型荧光定量方法,可以成功地分离出五种以上颜色荧光蛋白混合信号。这种荧光定量系统可以使得每一种荧光蛋白通过校正和计算后能读出其绝对浓度。我们选取了常用且成熟较快的荧光蛋白进行了纯化,并通过改变激发波长、曝光时间、滤光组测定各个荧光蛋白串色参数。此外,本文开发了一个可以快速构建多色基因报告子试剂盒,这非常有用和有意义:荧光蛋白基因序列和核糖体结合位点和中止子序列被整合成一个元件,因此根据实验需要可以很容易地将不同颜色的基因报告子组合起来。利用多色荧光校正系统和快速构建多色reporter试剂盒,我们构建了包含四种颜色荧光蛋白(sfgfp、mScarletI、Cyofp、Venus)的QS基因报告子,另一种红外荧光蛋白(sm URFP)用作细菌轮廓识别,初步将其应用到QS板底诱导实验等方面。多色荧光成像定量系统可以为解决其他生物问题提供一个新方法。综上所述,本研究紧密围绕铜绿假单胞菌群体感应方面展开,在基因报告子和多色荧光成像方面进行了技术改进并发现了鼠李糖脂阻挡QS信号分子的功能。这些科研发现和技术手段为今后的探索奠定了基础。