研究背景和目的癌症可以视为一种代谢性疾病,恶性肿瘤细胞能够在营养受限的肿瘤微环境中通过自身代谢重编程以满足快速增殖的需要。面对营养饥饿,肿瘤细胞的一种重要代谢策略便是激活自噬。自噬通过分解细胞内代谢产物如蛋白质、脂质或细胞器,循环利用,满足细胞在营养不足条件下生物合成和能量代谢的需要。目前的研究表明,自噬在多种肿瘤细胞中被异常激活,并与肿瘤的增殖、转移、耐药等现象密切相关。乳酸脱氢酶B（LDHB）,是糖酵解过程中重要的代谢酶之一,其催化乳酸和NAD+转化为丙酮酸,NADH和H+。研究证明在肿瘤细胞内,LDHB可以促进溶酶体酸化,自噬以及细胞增殖。然而,对于调控LDHB的分子机制却鲜有报道。蛋白质翻译后修饰可以显著影响多种代谢酶的相关功能,但是LDHB作为一种代谢酶,尚未见到其可以被翻译后修饰的研究报道。Sirtuin5（SIRT5）是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）依赖性的Ⅲ类去乙酰化酶sirtuin家族的成员,已有文献报道SIRT5具有调节肿瘤细胞糖酵解、脂肪酸氧化、三羧酸循环以及尿素循环的功能。然而,SIRT5对肿瘤细胞自噬的调节作用及其机制仍不清楚。本课题通过一系列实验,证实SIRT5可以通过调节LDHB酶活力影响肿瘤细胞自噬和增殖。方法构建Flag-SIRT5质粒,用Flag标签的琼脂糖珠富集SIRT5蛋白,采用质谱分析方法筛选与SIRT5可能相互作用的蛋白;通过免疫共沉淀、GST-Pulldown、蛋白免疫荧光共定位实验,进一步验证SIRT5与LDHB是否存在蛋白质直接相互作用及细胞亚定位情况;通过体内及体外蛋白乙酰化实验,证实LDHB是否可以被SIRT5去乙酰化修饰;将可能存在的LDHB乙酰化修饰位点失活/强制乙酰化突变,寻找SIRT5对LDHB去乙酰化修饰的赖氨酸位点。通过免疫沉淀技术获得LDHB蛋白纯化产物,检测LDHB活性,证实SIRT5对LDHB的翻译后修饰作用是否调节LDHB酶活力。在结直肠癌细胞HCT116中,通过自噬和凋亡蛋白检测、溶酶体酸性检测以及溶酶体成熟检测,观察SIRT5对LDHB的修饰是否会对肿瘤细胞自噬功能产生影响。通过乳酸测定、ATP测定以及海马生物代谢能量测定,观察LDHB乙酰化修饰是否会影响肿瘤细胞氧化呼吸功能。通过细胞计数、克隆形成实验及裸鼠皮下异种移植瘤实验观察SIRT5对LDHB的翻译后修饰是否会对结直肠癌细胞增殖及裸鼠皮下成瘤能力产生影响。回顾性分析54例结直肠癌患者的临床病理资料,取结直肠癌及相应的癌旁正常组织标本行LDHB蛋白特定位点乙酰化修饰的免疫组化检查。分析结直肠癌患者LDHB蛋白特定位点乙酰化修饰状态与患者临床参数的关系,进一步使用Kaplan–Meier曲线分析结直肠癌患者LDHB蛋白特定位点乙酰化修饰与预后的关系。结果质谱结果分析SIRT5可能与LDHB存在相互作用。Co-IP和GST-Pulldown实验证实SIRT5与LDHB间存在直接相互作用。免疫荧光共聚焦实验观察到SIRT5与LDHB共定位于细胞质中。通过体内及体外去乙酰化实验及后续的免疫印迹分析,证实在SIRT5的酶活性作用下,LDHB的329位赖氨酸（K）可被去乙酰化修饰,进而上调了LDHB酶活力。通过自噬和凋亡蛋白免疫印迹,溶酶体酸性及溶酶体成熟检测等实验技术,证实SIRT5可以通过去乙酰化修饰LDHB K329,促进溶酶体酸化和自噬。通过检测细胞乳酸、ATP的含量以及细胞线粒体氧耗率,我们发现LDHB K329的去乙酰化修饰可以促进肿瘤细胞以乳酸来源的线粒体氧化呼吸和能量的产生。通过体外细胞增殖实验、克隆形成及裸鼠皮下异种移植瘤模型实验,证实SIRT5对LDHB蛋白329位赖氨酸的去乙酰化修饰,可促进结直肠癌细胞体内和体外的增殖。通过荧光定量PCR、免疫沉淀、蛋白免疫印记分析等实验技术,还证实葡萄糖饥饿可以促进SIRT5表达,进一步减低LDHB K329乙酰化水平,最终增强LDHB酶活。最后,临床研究显示,结直肠癌原位肿瘤组织中LDHB的329位赖氨酸乙酰化水平明显低于正常结直肠组织,并且原发结直肠癌组织的LDHB的329位赖氨酸乙酰化水平与肿瘤大小（P=0.004）和组织学分级（P=0.031）呈负相关,与病人的总体生存率呈正相关（P=0.017）。结论SIRT5通过与LDHB直接相互作用,对LDHB蛋白329位赖氨酸位点去乙酰化修饰,进而提高LDHB酶活力,增强LDHB介导的溶酶体酸化和自噬,最终促进结直肠癌肿瘤细胞的增殖。SIRT5/LDHB轴有可能成为结直肠癌治疗的有效靶点。