骨化三醇促进肝样细胞成熟及缓解酒精性肝细胞损伤的机制研究

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骨化三醇(Calcitriol,1,25-dihydroxyvitamin D3)是维生素 D(VD)经过体内代谢后产生的生物活性最强的分子,该活化过程包括在肝脏和肾脏进行的两次羟基化修饰。骨化三醇的主要生理功能是促进肠道钙磷吸收、调节钙磷稳态及维持骨骼的健康生长。近些年来越来越多的研究发现,骨化三醇还广泛参与细胞增殖和分化、炎性免疫反应以及纤维化等生理和病理过程的调控。维生素D缺乏在世界范围内是一种非常普遍的现象,也逐渐引起人们的关注和重视。VD缺乏与各种骨骼和非骨骼等慢性疾病密切相关。已有报道VD缺乏在非酒精性和酒精性脂肪肝、肝炎和肝纤维化等肝脏疾病中广泛存在。越来越多的临床及基础研究也显示,低水平的VD与肝病患者的肝损伤程度呈正相关,补充VD可以改善慢性丙型肝炎的持续病毒学应答、抑制肝星状细胞激活以及缓解肝毒素诱导的大鼠肝硬化进展。鉴于骨化三醇和肝脏的密切关系和具有调控多种细胞分化的功能,本课题主要探讨骨化三醇对人多能干细胞来源的肝样细胞分化的调控和对酒精诱导的肝细胞损伤的保护作用及机制。人多能干细胞(hPSCs)分化来源的人肝细胞样细胞(HLCs)是药物毒性检测和再生医学很有前途的细胞来源。然而,目前HLCs的功能明显低于原代人肝细胞。在本课题的第一部分,我们在肝分化的过程中添加骨化三醇,探讨其对HLCs成熟基因的表达及功能成熟的影响。结果显示骨化三醇促进了人胚胎干细胞和人诱导性多能干细胞来源的HLCs的成熟相关基因的表达和P450系统解毒酶的活性、尿素生成及白蛋白分泌方面的功能。此外,骨化三醇还增加了线粒体呼吸酶复合物亚基的蛋白表达水平,增强了 HLCs的线粒体呼吸功能。进一步分析表明,骨化三醇诱导了线粒体生物发生调节因子的表达及线粒体自噬,进而调控线粒体功能。在VD受体(VDR)敲除的细胞株中,骨化三醇的这些作用消失,说明骨化三醇对HLCs功能成熟和线粒体功能的促进作用依赖于 VDR。过量酒精摄入会造成肝细胞损伤导致酒精性肝病的发生。近些年来,酒精导致的肝细胞损伤的机制研究已经取得了很多进展,然而,减少或挽救酒精所致肝细胞损伤的预防性干预手段仍然有限。我们发现在HLCs中骨化三醇对乙醇导致的肝细胞损伤有显著的保护作用,但并不影响乙醇代谢酶ADH1和CYP2E1的蛋白表达水平。因此,骨化三醇缓解酒精所致肝损伤的机制值得进一步探讨。在本课题的第二部分,我们先用骨化三醇预处理肝细胞再进行乙醇刺激。结果表明,骨化三醇预处理能显著提高肝细胞活力,降低细胞凋亡和氧化应激,并且减轻乙醇诱导的线粒体形态和膜电位异常。值得注意的是,骨化三醇显著增强了乙醇诱导的肝细胞自噬,表现为自噬小体和自噬溶酶体数量的增加,自噬标志蛋白LC3B-II和ATG5水平的上调以及促进自噬受体p62的降解。进一步研究发现,骨化三醇预处理增加了 GFP-LC3标记的自噬体与线粒体的共定位,提示骨化三醇有效地促进了乙醇诱导的线粒体自噬。此外,抑制自噬则减弱了骨化三醇的保护作用。对自噬相关调控通路的研究发现,骨化三醇通过AMPK/mTOR信号通路促进自噬作用,并且AMPK/mTOR信号通路的激活作用依赖于VDR。总之,骨化三醇通过激活AMPK/mTOR信号通路增强肝细胞自噬缓解了乙醇诱导的肝细胞损伤。综上所述,我们发现骨化三醇促进肝样细胞的功能成熟,为体外获得干细胞来源的成熟肝细胞提供了一种经济有效的方法。骨化三醇缓解乙醇诱导的肝细胞损伤的保护作用及其分子机制的阐述,为预防酒精性肝细胞损伤提供了新的策略和干预手段。
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