论文部分内容阅读
目的干细胞C3H10T1/2经Islet-1慢病毒载体感染后,诱导其向心肌细胞特异分化。通过检测心肌早期发育相关基因启动子区域组蛋白乙酰化和DNA甲基化的变化,来明确在此过程中两者之间的相互关系。方法1.以细胞密度为5×104/瓶将C3H10T1/2细胞铺于15 cm2培养瓶内,当细胞增殖至60%汇合时以Moi=20用相应量的高表达Islet-1的慢病毒感染细胞。感染后检测细胞转染效率,GFP荧光蛋白的表达以及Islet-1的表达,并观察形态学变化,检测向心肌分化过程中心肌特异性基因的表达;用染色质免疫共沉淀(CHIP)技术检测心肌发育早期基因启动子区组蛋白乙酰化的时序性变化,甲基化特异性PCR(MS-PCR)技术检测其启动子区DNA甲基化的时序性变化。2.5-aza处理感染高表达Islet-1慢病毒后的细胞,用CHIP检测心肌发育早期基因启动子区组蛋白乙酰化变化;TSA处理感染高表达Islet-1慢病毒后的细胞,用MS-PCR检测其启动子区DNA甲基化的变化。结果1.C3H10T1/2经高表达Islet-1的慢病毒感染后,可检测到荧光蛋白GFP及Islet-1蛋白表达于细胞,转染效率为95.4%。2.在诱导后3周后,多个视野下可观察到排列紧密且走向大致一致呈梭形的细胞群。诱导后细胞表达心肌特异性基因并呈现出一定的时序性。3.随着心肌发育早期基因GATA4的表达增高,其启动子区第2个Cp G位点组蛋白乙酰化的水平升高,DNA甲基化水平降低。4.用5-aza处理过的细胞GATA4基因启动子区组蛋白乙酰化的水平升高;用TSA处理过的细胞,其启动子区DNA甲基化水平降低。结论Islet-1诱导C3H10T1/2细胞向心肌细胞特异分化过程中,组蛋白乙酰化和DNA甲基化在调控心肌早期特异基因表达过程中存在相互拮抗作用关系,从而促其表达呈时序性变化。