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本文以实验室自制袋装青贮和不同地区青贮为样品,采用PCR-DGGE技术与传统的纯培养技术相结合,比较了玉米青贮和苜蓿青贮动态发酵过程中菌群多样性的变化;研究了不同地区青贮原料表面附着菌和半年以上青贮中菌群的多样性。得出以下结论:1.玉米青贮和苜蓿青贮中乳酸菌多样性研究玉米青贮pH值迅速降低,至试验结束,青贮各项营养指标均达到优质青贮指标;而苜蓿青贮pH值一直维持在5.5以上,其余各项营养指标均达到优质指标。利用细菌V3区通用引物扩增玉米青贮和苜蓿青贮中微生物16S rDNA,产物经DGGE分析发现,玉米青贮和苜蓿青贮发酵过程中优势条带不同;其中?-Acinetobacter、?-Pantoea、?-Escherichia、?-Lactococcus、?-Weissella koreensis、?-Enterobacter等类细菌一直活跃在青贮中;?-Streptococcus、?-Endophytic、?-Enterobacter等细菌7d后从玉米青贮体系中消失,而有些条带(克隆未成功)是在苜蓿青贮后期逐渐变亮,逐渐占据优势。利用细菌LAB类通用引物扩增玉米青贮和苜蓿青贮中微生物总16S rDNA,产物经DGGE分析发现,在青贮发酵过程中以?-Lactobacillus类居多,其次为?- Lactococcus和?- Weissella类;Lactobacillus brevis、?-Acetobacter、?-Leuconostoc在玉米青贮7d后有逐渐消失的趋势,而这几株菌在苜蓿青贮中一直存在,且没有显著变化。杆菌作为启动菌株一直存在于玉米及苜蓿青贮发酵体系中,且在青贮前(0d)及青贮后各时间点,条带一直较亮。利用传统纯培养技术对玉米青贮和苜蓿青贮各时间点乳酸菌进行分离、鉴定,共发现118株,其中乳酸杆菌57株、球菌61株。这些菌分别出现在两种原料中,并在各个时间分离出的LAB不同,前期以球菌居多,但随着青贮发酵时间的延长,青贮中的LAB种类由开始的球菌逐渐演替成杆菌。2.不同地区青贮原料表面附着菌及青贮中乳酸菌多样性研究不同地区青贮原料及青贮的营养成分差异显著,青贮中发酵产物差异性显著,原料发酵后符合优质青贮要求。利用细菌V3区通用引物扩增不同地区青贮原料表面附着菌及青贮中微生物16S rDNA,产物经DGGE方法分析发现:同一地区青贮原料表面附着菌的种类相似性比较高,最高达到93%最低也在80%以上;植株表面附着菌多为与青贮发酵无关的“杂菌”,LAB类较少,仅发现Lactococcus lactis subsp. Cremoris、Weissella koreensis、Lactobacillus buchneri等三种乳酸菌。不同地区青贮中细菌的种类相似性不高,仅在60%左右。检测出的菌群含有?-Acinetobacter、?-Pantoea、?-Escherichia、?-Pseudomonas等类“杂菌”,同时还检测出?-Lactobacillus、?-Lactococcus、?-Weissella等乳酸菌,这些菌群分布在各地区牧场青贮中。利用LAB类通用引物扩增不同地区青贮原料表面附着菌及青贮中微生物16S rDNA,产物经DGGE方法分析发现:不同地区青贮原料表面附着菌的种类相似性比较低,最高也只在75%左右,同一地区的相似性比较高,均在63%至94%之间;使用该LAB类通用引物扩增,发现的绝大部分是LAB,且以杆菌为主,球菌较少;其中Weissella confusa、Lactobacillus brevis、Acetobacter ghanensis、Lactococcus lactis、Weissella hellenica、Lactobacillus plantarum等菌种在九个牧场中均出现。不同地区青贮中乳酸菌经聚类分析发现九个牧场相似性不高,在67%至90%之间;且半年以上的青贮窖中以乳杆菌为主要类群(?- Lactobacillus),同时仍有球菌(Lactococcus、Weissella、Leuconostoc)出现。利用纯培养技术对不同地区青贮原料及半年以上青贮中LAB进行分离鉴定,不同地区青贮原料表面共分离出69株为乳酸菌,其中乳杆菌40株,乳球菌29株,地区不同乳酸菌种类有差异,而同一个地区植株表面的乳酸菌具有较高的相似性;于发酵半年以上的青贮中分离出46株为乳酸菌,均为乳杆菌,地区不同种类差异性较大,且同一个地区的三个牧场之间相似性也很低。传统纯培养技术与PCR-DGGE方法得出的结论并不完全一致,传统培养技术对LAB具有选择性培养,而DGGE更能真实的反映发酵体系中微生物结构。