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Neuropilins(NRPs)是一个新型的多功能受体，通过与3型semaphorins的结合，能够介导神经系统的发育，同时，通过与VEGF(vascular endothelialgrowth factor)家族的结合，介导血管的生成。NRPs家族包括NRP-1和NRP-22个成员，其中NRP-1在神经和心血管的发育中起到了关键性的作用；而NRP-2则在神经和淋巴管的生长过程中发挥作用。更重要的是，NRPs高表达于多种肿瘤细胞表面，并参与肿瘤的生长和肿瘤血管的生成。研究显示，阻断NRP-1与VEGF的结合，既能直接抑制肿瘤的生长，也能通过抑制肿瘤血管的生成间接抑制肿瘤生长。因此，NRP-1被认为是继VEGF后又一重要的，也是最有希望的抗肿瘤新靶标。本文通过基因工程技术获取了NRP-1 b1b2结构域的基因序列并表达蛋白，继而利用杂交瘤技术获得特异性针对此结构域的单克隆抗体。
我们利用RT-PCR技术获取NRP-1 b1b2结构域的基因，并将其克隆至质粒pET22b(+)，获得原核表达载体NRP-1 b1b2-pET22b(+)；重组质粒转化至E.coli Rosetta中，IPTG诱导表达，优化IPTG诱导剂量和诱导时间，确定目的蛋白的高效表达条件。镍亲和层析柱和HPLC纯化目的蛋白，并采用尿素梯度复性缓冲液透析复性。以复性蛋白免疫小鼠，取其脾细胞进行细胞融合，经过多次克隆筛选，获得NRP-1 b1b2单克隆抗体克隆细胞株，继而腹水生产并纯化抗体。ELISA实验鉴定抗体的亚型和滴度；Western blot、免疫共沉淀和荧光免疫组化实验鉴定抗体的特异性；DNAstar软件和DiscTope软件对NRP-1b1b2的表位进行预测并通过竞争性ELISA和免疫斑点实验对其进行鉴定。
结果表明，我们获得序列正确的重组质粒NRP-1 b1b2-pET22b(+)，其在E.coli Rosetta中主要以包涵体的形式高效表达；通过对诱导条件的优化，确定在终浓度为0.2 mmol/L的IPTG诱导条件下，最适诱导时间为4 h；经过2次融合，共筛选1500株杂交瘤细胞，获得57株阳性株，选取其中滴度最高的1株进行抗体的腹水生产；ELISA实验结果显示纯化抗体的亚型为IgG1，且滴度达到了1:32000； Western b1ot、免疫共沉淀和荧光免疫组化实验结果显示抗体不仅能够正确识别NRP-1b1b2融合蛋白，同时也能正确识别生理状态下全长的NRP-1；NRP-1b1b2多肽片段的竞争性ELISA和免疫斑点实验结果显示抗体与含线性抗原表位的NRP-1b1b2多肽片段不结合，提示抗体可能结合的是NRP-1b1b2抗原的构象表位。
总之，我们通过基因工程技术成功表达了融合蛋白NRP-1b1b2，并通过杂交瘤技术成功获得了NRP-1b1b2特异性单克隆抗体，为进一步探讨以NRP-1为靶位的新型抗肿瘤策略研究奠定了基础。