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滇重楼属于延龄草科(Trilliaceae)重楼属多年生草本植物,主要分布于我国云南、四川、贵州等地。滇重楼是一种重要的药用植物,主要以其干燥根状茎入药,根状茎中含有的活性成分为C-27甾体骨架的薯蓣皂苷元和偏诺皂苷元及其配糖体。植物内生菌(Endophyte)是指那些在其生活史的一定阶段或全部阶段生活于健康植物组织或器官内部的真菌或细菌,宿主不表现出外在病害症状。本论文对滇重楼(Parispolyphyllavar.yunnanensis(Franch)Hand)内生真菌的分离和鉴定、甾体化合物薯蓣皂苷元ELISA检测条件的摸索、内生真菌中甾体化合物分析、内生真菌提取物的抗菌活性进行初步研究,得出以下结果。
1、本研究首次对滇重楼根状茎内生真菌分离的方法进行探讨,对根状茎的表面消毒时间、分离部位和培养基的选择进行摸索,获得较为理想的分离效果。共分离到内生真菌133株,根据其形态特征,取28株代表性的真菌,经鉴定隶属于10个属,分别为酵母属(Candida)(No.1)、腐霉属(Pythium)(No.7)、丝核菌属(Rhizoctonia)(No.9)、木霉属(Trichoderma)(No.36)和帚梗柱孢属(Cylindrocladium)(No.108)各1株,青霉属(Penicillium)(No.15和No.65)2株,头孢霉属(Cephalosporium)(No.46、No.73和No.84)、曲霉属(Aspergillus)(No.47、No.55和No.61)和拟青霉属(Paecilomyces)(No.60、No.80和No.81)各3株,镰孢菌属(Fusarium)(No.14、No.24、No.32、No.38和No.62)5株。
2、当采用ELISA检测时,包被物的稀释倍数为1∶50,二抗的稀释倍数为1∶400,当薯蓣皂苷元浓度在2.44×10-6mg/mL~6.25×10-4mg/mL范围内,浓度自然对数与吸光值之间存在较好的线性关系。特异性检测显示,薯蓣皂苷元抗体相对于胆甾醇、β-谷甾醇、麦角甾醇的特异性较好。3、Liebermann-Burchard显色检测25、38、46、73、125号菌株的菌丝悬浮液甾体化合物产率较高;ELISA检测9、25、38、46、125号菌株的菌丝悬浮液中薯蓣皂苷元及其衍生物的含量较高;TLC检测表明:80、81、84、113号菌株菌丝正丁醇提取物中可能有薯蓣皂苷元;47、79、80、81、108、113、130号菌株的菌丝提取物中可能有麦角甾醇;14、65、130号菌株的菌液提取物中可能有麦角甾醇。此外,7、32、36、55、84、125菌株的滤液正丁醇提取物,9、15、32、36、38、46、61、62、73、84、119、125菌株的菌丝正丁醇提取物中可能还含有其他甾体类化合物。
4、28株内生真菌正丁醇提取物抗菌活性检测表明,在菌液正丁醇提取物中,24号菌株和55号菌株正丁醇提取物的抑菌活性较强;在菌丝正丁醇提取物中,9号菌株和130号菌株正丁醇提取物的抑菌活性较强。
本研究将为继续分离滇重楼内生真菌、了解内生真菌中的甾体化合物种类,以及抗菌活性成分奠定基础,同时也为阐明重楼内生真菌与宿主在次生代谢方面的协同进化规律提供依据。