光动力疗法（PDT）是一种通过光敏药物和激光激活来治疗肿瘤疾病的新方法。采取特定波长的激光光照肿瘤部位可以激活光敏药物,使该药物可以选择性地聚集在肿瘤组织中并引发光化学反应以破坏肿瘤。光敏剂（PS）,分子氧和激光是PDT的三个组成部分。在PDT处理中,首先将光敏剂注入患者体内或在皮肤表面覆盖一定时间,以确保PS被内化到组织中,然后预先准备了适当波长的激发光来照射靶组织以形成活性氧（ROS）,活性氧具有通过凋亡介导的细胞损伤、血管破坏和免疫应答激活来破坏癌细胞的能力。与传统疗法相比,PDT有其自身的优势,（a）双重选择性（b）无耐药性（c）非侵入性治疗（d）精准治疗、副作用低。但是,PDT也存在固有缺陷,只要部位存在光敏剂,激光照射到那个部位就会产生毒性。同时,药物毒副作用大的一个很大原因就是药物不仅在需要的目标中释放出来,而且还在其它器官组织中释放,对非靶向组织造成大的毒副作用。因此,直接靶向到癌细胞内甚至是亚细胞器内进行PDT,对提升PDT疗效和降低毒副作用显得尤为重要。细胞膜是防止细胞外物质自由进入细胞的堡垒,可确保细胞内环境的相对稳定性,并使各种生化反应能够有序地进行。细胞核是真核细胞的所有细胞结构中的重镇,它是细胞里遗传和代谢的调控中心。与其它文献报道的单靶点（如线粒体、溶酶体等）相比,细胞膜和细胞核双靶点能在破坏细胞防御,促进药物内吞的情况下,更精准地作用于控制遗传的细胞核上,阻止细胞复制分裂,从而控制癌症的发展。受此启发,我们猜测,设计一种用于亚细胞器质膜和细胞核双靶向的自递送嵌合肽纳米棒可直达PDT作用靶点,以达到精准PDT的效果并大大减少其毒副作用。研究目的在此次工作中,我们拟构建了用于质膜和细胞核双靶光敏剂递送的自递送嵌合肽纳米棒（表示为pnPNP）,以实现协同的原位光动力学治疗,并可进一步观察其在精准肿瘤治疗中的应用。为了突出pnPNP的双靶向PDT的优势,设计了具有单核靶向的pnNP用于对照组。研究方法1.pnPNP和pnNP的表征:用Nano-ZS ZEN360表征了粒径和Zeta电位。通过TEM观察形态。紫外可见吸收率是利用紫外可见分光光度计测量。2.pnPNP和pnNP的ROS产生能力:分别使用SOSG和DCFH-DA作为指示剂,通过荧光光谱仪和CLSM测量ROS的产生。3.细胞摄取和光触发的溶酶体逃逸:采用CLSM研究细胞摄取和光触发的溶酶体逃逸。4.pnPNP的质膜锚定和核靶向能力:采用CLSM方法研究pnPNP和pnNP对He La、CT26和4T1细胞的质膜锚定和核靶向能力。5.体外细胞毒性测量:通过MTT、流式细胞术和CLSM测量pnPNP和pnNP的细胞毒性。6.体内抗癌研究:当肿瘤体积达到大概100 mm3时,选择4T1荷瘤小鼠来评估pnPNP的抗肿瘤作用。将小鼠随机分为五组（每组五只小鼠）,包括PBS、pnPNP、pnNP、加激光照射的pnPNP、加激光照射的pnNP。将pnPNP和pnNP采取静脉注射方式注射到荷瘤小鼠中。在给药后20小时,对小鼠进行激光照射5分钟。每隔一天监测一次肿瘤体积和体重。15天后,采集肿瘤组织用于照相和称重。研究结果1、动态光散射（DLS）测量结果说明pnPNP和pnNP的纳米粒子分散均匀,尺寸分布狭窄。TEM图像表明,纳米棒长宽比为3-4,具有正电荷,这有利核渗透。从UV光谱中可看出pnPNP和pnNP大概在400 nm有尖峰,且500-700nm处有显著的Pp IX特征吸收峰。2、SOSG显示在没有光照射的情况下,在pnPNP和pnNP组中几乎没有荧光变化;在光照射下,在pnPNP组而不是在pnNP组中发现了更快的荧光增强;在CLSM的细胞内ROS检测中也发现了相似的结果,激光照射后在pnPNP组中检测到最强的绿色荧光。3、随着培养时间的增加,4T1细胞对pnPNP和pnNP的吸收均增强。但是,用pnPNP处理的4T1细胞的荧光强度比用pnNP处理的细胞的荧光强度高约10倍。Lyso-Tracker Green被发现与pnPNP和pnNP很好地匹配,这指示了纳米棒的内吞作用途径为溶酶体,在激光照射后,溶酶体绿色荧光信号在4T1细胞中消失了,这归因于pnPNP和pnNP对溶酶体结构的有效光动力破坏。4、pnPNP的红色荧光无论是在4T1、He La或CT26中均与细胞膜染料Di O的绿色荧光重叠,证明了pnPNP的出色的质膜靶向能力。在不存在或存在光照射的情况下,都能观察到pnPNP和pnNP的核靶向能力。5、体外细胞毒性显示,pnPNP和pnNP对4T1和He La细胞均表现出较低暗毒性和浓度依赖性的光毒性,且与pnNP相比,观察到pnPNP的光毒性明显更高。6、体内抗肿瘤研究显示,与PBS一样,用不加光照的pnPNP或pnNP注射几乎不能抑制肿瘤的生长。一旦暴露在光下,pnPNP和pnNP都对肿瘤的生长有明显的抑制作用,且pnPNP明显优于pnNP（P<0.05）。与核单靶点pnNP相比,用于光动力学癌症治疗的膜核双靶点pnPNP有着巨大优势。结论综上,我们构建了自递送嵌合肽纳米棒（表示为pnPNP）用于质膜和细胞核双靶向光敏剂递送,以实现协同的原位PDT。体外研究表明,双重靶向能力有益于pnPNP在质膜和细胞核中的高效亚细胞器定位。质膜靶向性pnPNP的PDT可以提高膜通透性,从而提高细胞摄取,甚至触发膜破坏并直接引起细胞坏死。在光照射下,内吞的pnPNP可以有效破坏溶酶体结构,并实现进一步核靶向PDT的核渗透。大量实验证明,质膜和核双靶PDT的抗肿瘤作用比单核靶PDT好得多。这种协同的亚细胞双重靶向策略最大程度地提高了PDT的治疗功效,这也为新型药物递送系统的开发提供了新的研究思路。