论文部分内容阅读
目的：APJ受体蛋白作为一种七次跨膜的G蛋白偶联受体，与其内源性活性肽配体Apelin所形成的Apelin/APJ系统在心血管疾病的发生发展中起着重要的作用。实验室前期报道Apelin-13/APJ系统通过诱导内质网自噬途径促进心肌细胞肥大，此外WesternBlot的结果发现，Apelin-13促进大鼠心肌细胞H9C2中Pannexin-1、FAM134B、自噬蛋白LC3以及细胞肥大因子ANP、BNP的表达。本文拟采用大鼠心肌细胞H9C2和小鼠心房肌细胞HL-1研究Apelin-13对Pannexin-1的蛋白水平、Pannexin-1半通道的开放、FAM134B的水平、内质网自噬和心肌细胞肥大的作用，在前期基础上进一步验证Apelin-13能否通过影响Pannexin-1蛋白的表达，并激活Pannexin-1半通道从而诱导FAM134B依赖性内质网自噬，作用于大鼠心肌细胞H9C2和小鼠心房肌细胞HL-1致使细胞肥大，从而揭示Apelin-13/APJ系统在心血管疾病中的作用机制，为将APJ受体作为心肌肥厚治疗的靶标提供新的理论基础。
方法：
1．RNA干扰：设计干扰链SiRNA-FAM134B抑制大鼠心肌细胞H9C2和小鼠心房肌细胞HL-1中FAM134B的表达；
2．免疫荧光技术观察Apelin-13、APJ受体拮抗剂F13A、Pannexin-1半通道抑制剂Carbrnoxolone和Probenecid处理后大鼠心肌细胞H9C2和小鼠心房肌细胞HL-1中Pannexin-1和FAM134B的表达，以及内质网常驻蛋白KDEL与自噬标志蛋白LC3B的共定位、KDEL与溶酶体标志蛋白CD63的共定位、FAM134B与自噬标志蛋白LC3的共定位；
3．荧光染料定量检测技术观察Apelin-13、APJ受体拮抗剂F13A、Pannexin-1半通道抑制剂Carbrnoxolone和Probenecid处理后大鼠心肌细胞H9C2和小鼠心房肌细胞HL-1中摄入荧光黄染料Luciferyellow的水平；
4．ATP试剂盒检测Apelin-13、APJ受体拮抗剂F13A、Pannexin-1半通道抑制剂Carbrnoxolone和Probenecid处理后大鼠心肌细胞H9C2和小鼠心房肌细胞HL-1中胞内ATP的水平；
5．免疫荧光技术观察Apelin-13、APJ受体拮抗剂F13A、Pannexin-1半通道抑制剂Carbrnoxolone和Probenecid、SiRNA-FAM134B处理后大鼠心肌细胞H9C2和小鼠心房肌细胞HL-1的细胞骨架大小；
6．ScepterTM细胞计数仪测量Apelin-13、APJ受体拮抗剂F13A、Pannexin-1半通道抑制剂Carbrnoxolone和Probenecid处理后小鼠心房肌细胞HL-1直径和体积变化；
7．BCA蛋白定量试剂盒检测Apelin-13、APJ受体拮抗剂F13A、Pannexin-1半通道抑制剂Carbrnoxolone和Probenecid处理后大鼠心肌细胞H9C2和小鼠心房肌细胞HL-1中蛋白质的浓度。
结果：
1．免疫荧光结果显示Apelin-13促进H9C2大鼠心肌细胞和HL-1小鼠心房肌细胞中Pannexin-1的表达，而APJ受体拮抗剂F13A、Pannexin-1半通道抑制剂Carbrnoxolone和Probenecid均抑制Apelin-13诱导的H9C2大鼠心肌细胞和HL-1小鼠心房肌细胞中Pannexin-1的表达.
2．免疫荧光结果显示Apelin-13促进H9C2大鼠心肌细胞和HL-1小鼠心房肌细胞对Luciferyellow的摄取，而APJ受体拮抗剂F13A、Pannexin-1半通道抑制剂Carbrnoxolone和Probenecid均逆转Apelin-13诱导的H9C2大鼠心肌细胞和HL-1小鼠心房肌细胞对Luciferyellow的摄取；
3．ATP试剂盒结果显示Apelin-13降低H9C2大鼠心肌细胞和HL-1小鼠心房肌细胞中ATP水平，而APJ受体拮抗剂F13A、Pannexin-1半通道抑制剂Carbrnoxolone和Probenecid均逆转Apelin-13降低的H9C2大鼠心肌细胞和HL-1小鼠心房肌细胞中ATP水平；
4．免疫荧光结果显示Apelin-13促进H9C2大鼠心肌细胞和HL-1小鼠心房肌细胞中内质网常驻蛋白KDEL与自噬标志蛋白LC3B的共定位，而APJ受体拮抗剂F13A、Pannexin-1半通道抑制剂Carbrnoxolone和Probenecid均抑制Apelin-13诱导的H9C2大鼠心肌细胞和HL-1小鼠心房肌细胞中内质网常驻蛋白KDEL与自噬标志蛋白LC3B的共定位;
5．免疫荧光结果显示Apelin-13促进H9C2大鼠心肌细胞和HL-1小鼠心房肌细胞中内质网常驻蛋白KDEL与溶酶体标志蛋白CD63的共定位，而APJ受体拮抗剂F13A、Pannexin-1半通道抑制剂Carbrnoxolone和Probenecid均抑制Apelin-13诱导的H9C2大鼠心肌细胞和HL-1小鼠心房肌细胞中内质网常驻蛋白KDEL与溶酶体标志蛋白CD63的共定位;
6．免疫荧光结果显示APJ受体拮抗剂F13A、Pannexin-1半通道抑制剂Carbrnoxolone和Probenecid均抑制Apelin-13诱导的H9C2大鼠心肌细胞和HL-1小鼠心房肌细胞中FAM134B的表达;
7．免疫荧光结果显示APJ受体拮抗剂F13A、Pannexin-1半通道抑制剂Carbrnoxolone和Probenecid均抑制Apelin-13诱导的H9C2大鼠心肌细胞和HL-1小鼠心房肌细胞中FAM134B与自噬标志蛋白LC3的共定位；
8．免疫荧光结果显示APJ受体拮抗剂F13A、Pannexin-1半通道抑制剂Carbrnoxolone和Probenecid、SiRNA-FAM134B均抑制Apelin-13诱导的H9C2大鼠心肌细胞和HL-1小鼠心房肌细胞肥大；
9．手持细胞计数仪和BCA蛋白定量试剂盒的结果显示APJ受体拮抗剂F13A、Pannexin-1半通道抑制剂Carbrnoxolone和Probenecid均抑制Apelin-13诱导的HL-1小鼠心房肌细胞直径、体积和蛋白质表达增加；
结论：Pannexin-1半通道开放诱导FAM134B依赖性内质网自噬途径介导Apelin-13促大鼠心肌细胞H9C2和小鼠心房肌细胞HL-1肥大.
方法：
1．RNA干扰：设计干扰链SiRNA-FAM134B抑制大鼠心肌细胞H9C2和小鼠心房肌细胞HL-1中FAM134B的表达；
2．免疫荧光技术观察Apelin-13、APJ受体拮抗剂F13A、Pannexin-1半通道抑制剂Carbrnoxolone和Probenecid处理后大鼠心肌细胞H9C2和小鼠心房肌细胞HL-1中Pannexin-1和FAM134B的表达，以及内质网常驻蛋白KDEL与自噬标志蛋白LC3B的共定位、KDEL与溶酶体标志蛋白CD63的共定位、FAM134B与自噬标志蛋白LC3的共定位；
3．荧光染料定量检测技术观察Apelin-13、APJ受体拮抗剂F13A、Pannexin-1半通道抑制剂Carbrnoxolone和Probenecid处理后大鼠心肌细胞H9C2和小鼠心房肌细胞HL-1中摄入荧光黄染料Luciferyellow的水平；
4．ATP试剂盒检测Apelin-13、APJ受体拮抗剂F13A、Pannexin-1半通道抑制剂Carbrnoxolone和Probenecid处理后大鼠心肌细胞H9C2和小鼠心房肌细胞HL-1中胞内ATP的水平；
5．免疫荧光技术观察Apelin-13、APJ受体拮抗剂F13A、Pannexin-1半通道抑制剂Carbrnoxolone和Probenecid、SiRNA-FAM134B处理后大鼠心肌细胞H9C2和小鼠心房肌细胞HL-1的细胞骨架大小；
6．ScepterTM细胞计数仪测量Apelin-13、APJ受体拮抗剂F13A、Pannexin-1半通道抑制剂Carbrnoxolone和Probenecid处理后小鼠心房肌细胞HL-1直径和体积变化；
7．BCA蛋白定量试剂盒检测Apelin-13、APJ受体拮抗剂F13A、Pannexin-1半通道抑制剂Carbrnoxolone和Probenecid处理后大鼠心肌细胞H9C2和小鼠心房肌细胞HL-1中蛋白质的浓度。
结果：
1．免疫荧光结果显示Apelin-13促进H9C2大鼠心肌细胞和HL-1小鼠心房肌细胞中Pannexin-1的表达，而APJ受体拮抗剂F13A、Pannexin-1半通道抑制剂Carbrnoxolone和Probenecid均抑制Apelin-13诱导的H9C2大鼠心肌细胞和HL-1小鼠心房肌细胞中Pannexin-1的表达.
2．免疫荧光结果显示Apelin-13促进H9C2大鼠心肌细胞和HL-1小鼠心房肌细胞对Luciferyellow的摄取，而APJ受体拮抗剂F13A、Pannexin-1半通道抑制剂Carbrnoxolone和Probenecid均逆转Apelin-13诱导的H9C2大鼠心肌细胞和HL-1小鼠心房肌细胞对Luciferyellow的摄取；
3．ATP试剂盒结果显示Apelin-13降低H9C2大鼠心肌细胞和HL-1小鼠心房肌细胞中ATP水平，而APJ受体拮抗剂F13A、Pannexin-1半通道抑制剂Carbrnoxolone和Probenecid均逆转Apelin-13降低的H9C2大鼠心肌细胞和HL-1小鼠心房肌细胞中ATP水平；
4．免疫荧光结果显示Apelin-13促进H9C2大鼠心肌细胞和HL-1小鼠心房肌细胞中内质网常驻蛋白KDEL与自噬标志蛋白LC3B的共定位，而APJ受体拮抗剂F13A、Pannexin-1半通道抑制剂Carbrnoxolone和Probenecid均抑制Apelin-13诱导的H9C2大鼠心肌细胞和HL-1小鼠心房肌细胞中内质网常驻蛋白KDEL与自噬标志蛋白LC3B的共定位;
5．免疫荧光结果显示Apelin-13促进H9C2大鼠心肌细胞和HL-1小鼠心房肌细胞中内质网常驻蛋白KDEL与溶酶体标志蛋白CD63的共定位，而APJ受体拮抗剂F13A、Pannexin-1半通道抑制剂Carbrnoxolone和Probenecid均抑制Apelin-13诱导的H9C2大鼠心肌细胞和HL-1小鼠心房肌细胞中内质网常驻蛋白KDEL与溶酶体标志蛋白CD63的共定位;
6．免疫荧光结果显示APJ受体拮抗剂F13A、Pannexin-1半通道抑制剂Carbrnoxolone和Probenecid均抑制Apelin-13诱导的H9C2大鼠心肌细胞和HL-1小鼠心房肌细胞中FAM134B的表达;
7．免疫荧光结果显示APJ受体拮抗剂F13A、Pannexin-1半通道抑制剂Carbrnoxolone和Probenecid均抑制Apelin-13诱导的H9C2大鼠心肌细胞和HL-1小鼠心房肌细胞中FAM134B与自噬标志蛋白LC3的共定位；
8．免疫荧光结果显示APJ受体拮抗剂F13A、Pannexin-1半通道抑制剂Carbrnoxolone和Probenecid、SiRNA-FAM134B均抑制Apelin-13诱导的H9C2大鼠心肌细胞和HL-1小鼠心房肌细胞肥大；
9．手持细胞计数仪和BCA蛋白定量试剂盒的结果显示APJ受体拮抗剂F13A、Pannexin-1半通道抑制剂Carbrnoxolone和Probenecid均抑制Apelin-13诱导的HL-1小鼠心房肌细胞直径、体积和蛋白质表达增加；
结论：Pannexin-1半通道开放诱导FAM134B依赖性内质网自噬途径介导Apelin-13促大鼠心肌细胞H9C2和小鼠心房肌细胞HL-1肥大.