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在转基因检测领域,标准质粒以容易获得、纯度高、成本低和稳定性好的优点逐渐发展成为受欢迎的一种标准物质(替代品),更适合同时对多个靶标基因的检测。为解决阳性标准物质不容易获得的困难,本研究构建了适合常见转基因水稻和棉花产品PCR检测的四个标准质粒,以我国4个转基因水稻品系和16个转基因棉花品种(品系)为研究材料,对其作为标准物质在转基因检测中的适用性进行了初步验证。主要结果如下:1.构建了适合于转基因抗虫水稻科丰6号品系特异性检测的标准质粒pMD-KF6,建立了相应的实时荧光定量PCR检测方法。该质粒全长为3100 bp,通过在pMD18-T载体的克隆位点和HindIII酶切位点分别插入gos9序列和科丰6号5?端旁侧序列构建,为闭合环状双链DNA。建立了基于5?端旁侧序列的科丰6号产品品系特异性实时荧光定量PCR方法。5?旁侧和gos9两个标准曲线的相关系数(R2)分别为0.999和0.998,扩增效率(E)分别为96.8%和97.2%,定量检测限为10个拷贝。对5%和1%两个混合样品进行定量检测,评价和验证所建立的定量方法,结果显示准确性偏离率分别为4.0%和17.0%,精确性相对标准差(RSD)分别为3.96%和3.42%。表明本研究建立的PCR定量检测方法可以用于含有科丰6号转基因水稻产品的品系特异性定量检测,所构建的标准质粒pMD-KF6可以代替其基因组DNA作为标准物质使用。2.构建了适合于转基因抗虫水稻Bt汕优63品系特异性检测的标准质粒pMDBt63,建立了相应的实时荧光定量PCR检测方法。该质粒全长3137 bp,通过在pMD18-T载体的克隆位点和EcoRⅠ酶切位点分别插入gos9序列和Bt汕优63 3?端旁侧序列构建。基于3?端旁侧序列的Bt汕优63产品品系特异性实时荧光定量PCR方法的两个标准曲线的相关系数(R2)分别为0.9997和0.9992,扩增效率(E)分别为98.05%和99.46%。检测限为10拷贝,定量限为100拷贝。应用建立的方法对5%和1%两个混合样品进行定量检测结果的准确性偏离率(bias)分别为0.02和0.07,相对标准差(RSD)分别为1.23%和5.61%。以上结果表明,本研究建立的PCR定量检测方法可以用于含有Bt汕优63转基因水稻产品的品系特异性定量检测,所构建的标准质粒pMDBt63可以代替其基因组DNA作为标准物质使用。3.结合对多靶标进行PCR定量检测的技术要求,探索构建了适合于克螟稻等4个转基因抗虫水稻品系特异性检测的多靶标标准质粒pMD68DH,建立了相应的实时荧光定量PCR检测方法。该质粒全长为5152 bp,通过在pMD18-T载体的克隆位点以及载体上的EcoRⅠ、BamHⅠ、HindIII 3个酶切位点分别插入四个转基因水稻5?和3?端旁侧序列以及水稻gos9、PLD和SPS三个内标准基因序列构建。为验证pMD68DH用于多个转基因水稻产品定量检测的适用性,以科丰8号和克螟稻水稻样品DNA为检测对象,选择gos9基因作为定量的内标准基因,分别建立了针对科丰8号和克螟稻2个抗虫水稻产品的品系特异性定量PCR检测方法。定量检测限均为10拷贝。应用所建立的PCR检测方法分别对5%和1%两个转基因含量的科丰8号和克螟稻水稻样品DNA进行了定量检测验证。科丰8号定量检测结果标准偏差分别为21.6%和7.0%,精确性相对标准差分别为2.3%和7.48%。克螟稻定量检测结果的准确性标准偏差分别为2.8%和1.0%,精确性相对标准差分别为3.29%和7.92%。以上结果表明,pMD68DH适合作为标准物质(替代品)用于有关转基因水稻产品的PCR定量检测。4.针对我国转基因抗虫棉常用的主要转基因元件和外源基因类型,结合对多靶标对象进行PCR定量检测的技术要求,构建了适合于我国目前转基因抗虫棉花产品检测的多靶标标准质粒pMDMCS,建立了针对不同靶标对象的实时荧光定量PCR检测方法。该质粒全长为4309 bp,在pMD20-T载体基础上构建,包括CaMV35S启动子、pNOS启动子、NOS终止子、7S终止子、nptII标记基因、CpTI抗虫基因和cry1A抗虫基因等7个外源基因靶标序列和棉花内标准Sad1基因序列。根据上述cry1A抗虫基因等转基因检测靶标序列和Sad1棉花内标准基因对多靶标序列PCR定量检测的技术要求,研究建立了针对不同靶标的实时荧光定量PCR方法。经测试,所建立的定量标准曲线相关参数均符合PCR定量检测要求。以这些方法对我国16个抗虫棉品种(品系)样品中7个检测对象进行了PCR定量检测的实验应用。定量结果表明,CaMV35S启动子、NOS终止子、7S终止子、nptII标记基因及cry1A抗虫基因在我国抗虫棉品种中较为稳定存在,pNOS启动子和CpTI抗虫基因剂量均低于0.3拷贝。