唾液酸（sialic acid,SA）是一类带负电荷的九碳单糖家族的总称,广泛分布于脊椎动物,植物和微生物中。在生物体中,唾液酸通常表达于细胞的表面,在生物体的免疫系统调节,病毒感染以及肿瘤发育中发挥着多种功能。生物体内唾液酸代谢一般跟两种酶密切相关,分别是CMP-唾液酸合成酶（CSS）和唾液酸转移酶（ST）。由于唾液酸具有重要的生物学作用,近年来对生物体细胞表面唾液酸进行标记和呈像成为一个有吸引力的研究方向。基于生物正交化学反应的代谢性聚糖标记和化学酶法标记是细胞聚糖标记常用的两种方法。这两种方法最初都是采用两个步骤来进行标记。代谢性聚糖标记第一步是将带有生物正交官能团修饰的唾液酸类似物经细胞内的聚糖代谢系统表达在细胞表面,第二步则采用互补的生物正交探针进行共价标记。然而该技术具有明显的局限性,首先是会对生物体造成不可控制的大规模扰动,其次基于生物正交反应的两步法效率比较低。化学酶法标记则是通过底物识别范围较广的唾液酸转移酶先将带有正交反应手柄的CMP-唾液酸类似物转移到细胞表面,然后再通过生物正交反应进行标记。不可避免的,其同样也存在生物正交反应标记效率低的问题。后来发展了一步法的化学酶法标记技术,直接通过唾液酸转移酶将荧光基团的CMP-唾液酸类似物转移到细胞表面进行标记,使得对细胞表面唾液酸标记效率大大提高。但是由于CMP-唾液酸合成酶（CSS）对于荧光唾液酸类似物的催化活性较弱,所以目前用于一步化学酶法标记的荧光CMP-唾液酸类似物原料主要采用化学方法合成。先使用CMP-唾液酸合成酶（CSS）合成CMP-唾液酸类似物,再通过化学合成偶联荧光基团。在这个过程中,由于CMP-唾液酸类似物稳定性较差,非常容易水解,导致生成的荧光CMP-唾液酸类似物产率较低。因此采用蛋白质改造技术提高CMP-唾液酸合成酶（CSS）对于荧光唾液酸类似物的催化活性,对于大量合成荧光CMP-唾液酸类似物原料以提高一步化学酶法标记效率的提高有很大的意义。本研究基于计算机理性设计来对实验室已有的脑膜炎奈瑟氏球菌CMP-唾液酸合成酶（Nm CSS）)进行定点突变,来提高其对于荧光唾液酸类似物^FITC-SA的酶活。主要研究内容如下:（1）以^9-NH2-SA和FITC为原料,化学方法合成荧光唾液酸类似物^FITC-SA。（2）将^FITC-SA与Nm CSS晶体结构进行分子对接,得到^FITC-SA与Nm CSS的初步结合模式。分析结合模式发现,138位的组氨酸H和173位的精氨酸R对于Nm CSS结合^FITC-SA具有潜在的阻碍作用。（3）针对Nm CSS的138位组氨酸和173位精氨酸设计定点突变,构建突变载体Nm CSS-H138A,Nm CSS-R173A,以及Nm CSS-H138A R173A。（4）相关突变蛋白在大肠杆菌中诱导表达并纯化。蛋白酶活测定采用孔雀石绿检测磷酸根的方法进行。结果显示,Nm CSS的3个突变体对于天然底物唾液酸活性均有一定下降,而对^FITC-SA活性则有提升。跟野生型Nm CSS相比较,3个突变体对^FITC-SA酶活提高了4倍左右。其中Nm CSS-R173A的酶活比Nm CSS-H138A和Nm CSS-H138A R173A略高一点。本研究通过理性设计并结合实验验证,获得了对^FITC-SA识别能力及亲和性更高的3个Nm CSS突变体。该突变体的获得为Nm CSS进一步应用于化学酶法标记细胞表面唾液酸奠定了基础。