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糖胺聚糖（Glycosaminoglycan,GAG）是一类以葡萄糖醛酸和N-乙酰氨基葡萄糖（N-乙酰氨基半乳糖）为二糖单位组合而成的聚合物并经硫酸化、变构化修饰而成的酸性、直链多糖,广泛存在于动物细胞表面和周围基质中。糖胺聚糖具有多种生物学功能包括调节细胞生长、增殖和分化等,被开发成一系列的化妆品、医美和医药产品,其中硫酸软骨素是一种治疗骨关节炎的药物,肝素用于治疗抗坏血栓及作为术后抗凝血药。目前硫酸软骨素和肝素主要从动物组织中提取,需消耗大量的酸碱,而且该方法制备的硫酸软骨素和肝素中含有大量的其他糖胺聚糖,不仅降低它们的药效,甚至危及生命。因此,合成结构单一的硫酸软骨素和肝素势在必行,对它们的临床应用和新功能的开发尤为重要。本文采用酶法催化软骨素和肝素前体合成单一的硫酸软骨素和肝素。在此过程中,硫酸化所需的硫酸化修饰系统和硫酸基供体3?-磷酸腺苷-5?-磷酸硫酸（3?-phosphoadenosine-5?-phosphosulfate,PAPS）再生系统尤为重要。本论文通过在大肠杆菌（Escherichia coli）中表达鼠源酰基磺酸转移酶（Aryl sulfotransferase IV,ASSTIV）,构建PAPS再生系统;通过在毕赤酵母（Pichia pastoris）中表达动物源硫酸转移酶及差向异构酶构建硫酸化修饰系统。在此基础上,整合PAPS再生系统及硫酸化修饰系统合成硫酸软骨素和肝素。主要研究结果如下:（1）优化ASSTIV表达构建PAPS高效再生系统。分别以pET20b和pColdIII为载体在E.coli BL21中表达ASSTIV,由SDS-PAGE和酶活分析可知pColdIII比pET20b更适合ASSTIV的表达。为了纯化及突变方便,选择10种信号肽构建ASSTIV的分泌表达系统,结果表明YebF,Cex及PelB等3种信号肽能实现ASSTIV的分泌表达,其中PelB的分泌能力最强,胞外上清的酶活达到0.36±0.01 U/mL。为了提高E.coli BL21对ASSTIV的分泌能力,对PelB信号肽C-端进行随机突变,突变成ASSTM3（AGA）时胞外酶活达到1.49±0.02 U/mL。在酶分子水平,通过随机突变ASSTIV的底物结合口袋门控序列85-Val-Pro-Ser-Gly-Leu-Glu-Thr-Leu-Glu-Glu-Thr-95,筛选到正突变株L89S/E90L。进一步对以上两个位点进行单点饱和突变和组合突变得到突变株L89M/E90Q的比酶活为5.98?0.15 U/mg,是出发菌株的1.76倍,Kcat/Km相较于原酶提高了12.5倍。（2）表达硫酸转移酶和差向异构酶构建硫酸化修饰系统。首先,比较在E.coli和P.pastoris等宿主中表达哺乳动物源硫酸转移酶和差向异构酶的差异性以选择合适的表达宿主。在E.coli中,以T7为启动子表达上述酶类时,SDS-PAGE分析表明N-脱乙酰-N-硫酸转移酶（N-Deacetylase-N-sulfotransferase,NDST）、葡萄糖醛酸差向异构酶（C5 epimerase,C5epi）、软骨素-4-硫酸转移酶（Chondroitin-4-sulfotransferase,C4ST）和软骨素-6-硫酸转移酶（Chondroitin-6-sulfotransferase,C6ST）未表达;肝素-2-羟基硫酸转移酶（Heparan sulfate 2-O-sulfotransferase,HS2ST）、肝素-6-羟基硫酸转移酶（Heparan sulfate 6-O-sulfotransferase,HS6ST）和肝素-3-羟基硫酸转移酶（Heparan sulfate 3-O-sulfotransferase,HS3ST）以包涵体形式表达。在上述蛋白的N-端融合麦芽糖融合蛋白（Maltose binding protein,MBP）后,NDST和C5epi以包涵体的形式表达;HS2ST、HS6ST和HS3ST实现可溶表达;C4ST和C6ST依旧没有表达。在P.pastoris中,以AOX为启动子,HS3ST、C4ST和C6ST得以成功表达并分泌到胞外,C5epi实现胞内表达,其余包括NDST、HS2ST和HS6ST没有表达。在N-端融合MBP后,NDST、C5epi、HS2ST、HS6ST实现分泌表达。在HS2ST和HS6ST基因N端同时融合MBP和硫氧还蛋白（Thiredoxin,TrxA）后,HS2ST和HS6ST的表达量得以提高。（3）利用软骨素硫酸转移酶催化软骨素合成硫酸软骨素。首先以软骨素为底物测定P.pastoris分泌表达的C4ST和C6ST酶活分别为0.101?0.001 U/L和0.100?0.002 U/L,比酶活分别为0.30?0.01 U/mg和0.20?0.01 U/mg。此外,体外酶法催化能提高动物源硫酸软骨素的硫酸化度,C4ST催化能提高硫酸软骨素中GlcUA-GalNAc（4S）比例,C6ST催化能提高硫酸软骨素中GlcUA-GalNAc（6S）比例。分别利用C4ST和C6ST催化软骨素37oC反应48 h,得到的产物进行LC-IT-TOF-MS、红外及核磁共振鉴定,结果表明C4ST催化软骨素合成硫酸软骨素A,C6ST催化软骨素合成硫酸软骨素C。由此实现了体外酶法合成特定硫酸软骨素。（4）利用肝素硫酸化修饰系统催化肝素前体合成肝素。P.pastoris表达的NDST同时具有脱乙酰化酶酶活和N-硫酸转移酶酶活,N-硫酸转移酶酶活比E.coli表达的NDST的N-硫酸转移酶酶活高24.46倍,达到0.52?0.01 U/mL。此外,P.pastoris表达的C5epi、HS2ST、HS6ST和HS3ST的酶活分别为3.28?0.07 U/L、5.33?0.22 U/L,4.50?0.13 U/L和12.50?0.43U/L,均比E.coli表达的C5epi、HS2ST、HS6ST及HS3ST的酶活高。利用重组P.pastoris表达的HS2ST、HS6ST和HS3ST修饰动物源肝素提高抗凝血活性148%,达到189?17 IU/mg。在此基础上,以P.pastoris表达的NDST、C5epi、HS2ST、HS6ST及HS3ST构成的肝素硫酸转移酶修饰系统和PAPS再生系统催化肝素前体形成含有核心五糖中与抗凝血蛋白结合的三糖结构GlcNS（6S）-IdoA（2S）-GlcNS（6S,3S）。由此实现了体外酶法合成肝素,且抗凝血活性达到23?4 IU/mg。