表皮生长因子受体突变体Ⅲ（Epidermal growth factor receptor variant Ⅲ,EGFRvⅢ）作为表皮生长因子受体（Epidermal growth factor receptor,EGFR）最重要的突变体之一,已在多种肿瘤中检测到,但在正常组织中几乎检测不到,是肿瘤特异性诊断或免疫治疗的理想靶点。最近本研究团队研发了一种新的抗EGFRvⅢ单克隆抗体4G1对EGFRvⅢ具有高特异性和亲和力。放射性标记的4G1在表达EGFRvⅢ蛋白的肿瘤单光子发射计算机断层成像/计算机断层成像（Single-photon emission computed tomography/computed tomography,SPECT/CT）中显示出了优异的效果,研究证实4G1是具有前景的靶向EGFRvⅢ的分子探针。然而,完整抗体分子探针尚存在分子量较大,在正常器官中滞留时间长,血液清除缓慢,通透性和保留作用增强等不足,为了进一步优化4G1的显像效果,本研究制备了单克隆抗体4G1的Fab片段,并用¹³¹ I标记后评估其应用于放射免疫显像的潜力。目的:制备抗EGFRvⅢ单克隆抗体4G1的Fab片段,并评估¹³¹I标记的Fab片段的放射免疫显像潜力。实验方法与结果:第一部分抗EGFRvⅢ单克隆抗Fab片段的制备与鉴定方法:固定的无花果蛋白酶消化完整的抗体4G1,消化产物经蛋白A柱纯化后得到纯化的Fab片段。SDS-PAGE检测Fab的分子量,Western blot、流式细胞术和免疫荧光实验检测Fab的特异性,ELISA检测Fab亲和力。结果:SDS-PAGE结果显示纯化后的Fab分子量约为40 kDa,分子量大小符合预期,且纯化产物未见杂带。Western blot结果显示Fab和4G1仅在145 kDa处特异性识别F98_npEGFRvⅢ细胞表达的EGFRvⅢ蛋白,但无法识别F98_EGFR细胞表达的EGFR蛋白;流式细胞术结果显示4G1和Fab与F98_npEGFRvⅢ细胞的结合率分别为99.6%和59.9%,与F98_EGFR细胞的结合率分别为2.80%和2.06%;免疫荧光结果显示Fab和4G1能特异性与F98_npEGFRvⅢ细胞结合,几乎不能与F98_EGFR细胞的结合。ELISA测得Fab和4G1的Kd值分别为（9.40±0.89）nmol/L和（0.29±0.03）nmol/L,Fab亲和力较亲本抗体4G1有所降低。第二部分抗EGFRvⅢ单克隆抗Fab片段的放射性标记与鉴定方法:采用氯胺-T法对Fab和4G1进行¹³¹I标记,采用纸层析法测定标记产物的标记率。标记产物立即通过PD midiTrap G-25柱分离纯化后采用纸层析法测定放射化学纯度。结果:¹³¹I对Fab和4G1的标记率分别为（86.63±2.39）%和（90.04±3.11）%,放射化学纯度分别为（97.71±0.28）%和（96.59±1.25）%。第三部分¹³¹I-Fab在荷瘤裸鼠中的生物分布和放射免疫显像的比较分析方法:将过表达EGFRvⅢ蛋白的F98_npEGFRvⅢ细胞注射到四周龄雌性BALB/c裸鼠的右后肢皮下,构建荷EGFRvⅢ阳性肿瘤裸鼠模型。当肿瘤体积达500 mm³时,通过尾静脉分别注射¹³¹I-Fab或¹³¹I-4G1到荷瘤裸鼠中并于2 h、4 h、24 h、48 h后进行生物分布研究;当肿瘤体积达1000 mm³时,通过尾静脉分别注射¹³¹I-Fab或¹³¹I-4G1到荷瘤裸鼠中并于2 h、4 h、24 h、48 h后进行放射免疫显像研究。结果:肿瘤对¹³¹I-Fab的摄取在注射后2 h、4 h、24 h、48 h分别为（7.59±0.56）%ID/g、（4.38±0.74）%ID/g、（1.02±0.19）%ID/g、（0.40±0.02）%ID/g;肿瘤对¹³¹I-4G1的摄取在注射后2 h、4 h、24 h、48 h分别为（14.09±2.59）%ID/g、（17.50±4.05）%ID/g、（10.53±1.06）%ID/g、（9.08±0.60）%ID/g,肿瘤在各时间点对¹³¹I-Fab的摄取均较¹³¹I-4G1降低,但¹³¹I-Fab在正常器官中清除更快。放射免疫显像结果显示,¹³¹I-Fab注射后2 h肿瘤部位显影清晰,且较¹³¹I-4G1能更快地代谢清除。结论:碘-131标记的抗EGFRvⅢ抗体的Fab片段有望成为EGFRvⅢ阳性肿瘤放射免疫成像的显像剂。