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球形芽胞杆菌(Lysinibacillussphaericus)是一种在自然界中广泛分布的好氧芽胞杆菌。由于其对蚊幼虫具有特异性毒杀作用,在世界范围内被成功地应用于疾病媒介蚊虫的生物防治。球形芽胞杆菌表面包裹着表层蛋白(surfacelayerprotein,S-层蛋白),其编码基因并不保守,有毒株和无毒株的S-层蛋白形成的晶格类型也不同,其包装方式应该存在差异。目前对球形芽胞杆菌S-层蛋白的研究主要集中在无毒株上,对有毒株的S-层蛋白的研究鲜为报道,因此开展有毒株的S-层蛋白的结构和功能研究,对深入了解其锚定和自组装特性及其生物学功能和应用具有重要的理论意义和实际应用价值。
本研究通过序列分析发现球形芽胞杆菌高毒力菌株C3-41与高毒力菌株2362具有完全相同的S-层蛋白序列,与其它有毒菌株1593、SSII-1、IAB881和2317-2的S-层蛋白具有很高同源性(98％以上),而与无毒菌株CCM2177、P1、NCTC9602和JG-A12的同源性较低(30％以下)。无毒株和有毒株的S-层蛋白在进化树上位于不同的分支,具有明显的差异。
根据S.蛋白基因的序列分析结果,进行C3-41的S-层蛋白基因的系列缺失,并完成全长基因和序列缺失基因片段在大肠杆菌中的异源表达,研究全长蛋白和不同截短蛋白在大肠杆菌中的自组装特性。在此基础上,研究纯化的各蛋白与不同来源的细菌的细胞壁的锚定功能及自组装特性。结果表明,球形芽胞杆菌C3-41的S-层蛋白具有两个独立的功能域,其N端31-210个氨基酸负责S-层蛋白与细胞壁上的次级细胞壁聚合物的结合,中部与C端的211-1176个氨基酸与S-层蛋白的自组装功能相关。深入的研究证明,球形芽胞杆菌C3-41的S-层蛋白对细胞壁的锚定具有种属特异性,只能和球形芽胞杆菌的细胞壁结合,而不能和别的种属的细菌的细胞壁结合；N端的S-层同源区(S-layerhomology,SLH)的三个SLH基序(SLHmotif),第一个和第二个SLH基序与细胞壁的结合不稳定,而第三个SLH基序能与细胞壁稳定结合,因此第三个SLH基序是与细胞壁稳定结合的关键区域；体内和体外的自组装特性分析表明,N端缺失497个氨基酸,C端缺失126个氨基酸不影响S-层蛋白的自组装功能。C端缺失126个氨基酸,N端缺失277个氨基酸,S-层蛋白在胞内自组装形成的多层柱状产物和全长蛋白形成的自组装产物相似,但N端进一步的截短会使S-层蛋白片段在胞内主要形成单层柱状的组装产物。由此可见N端的第278-497个氨基酸与S-层蛋白形成多层柱状结构的组装产物相关,缺失后S-层蛋白由多层柱状结构的组装产物转变为单层柱状结构,但有关不同类型产物的自组装机理还有待进一步研究。
本研究确定了锚定和自组装两个功能域在全长蛋白中所处的位置,并进一步确定维持稳定锚定和自组装所需的核心片段。第一次对高毒力的球形芽胞杆菌的S-层蛋白的锚定和自组装功能进行了深入的研究,对C3-41的S-层蛋白的锚定和自组装的特性有了较为全面的了解,C3-41的S-层蛋白只与球形芽胞杆菌的细胞壁特异性结合的特性为球形芽胞杆菌的鉴定提供了一种新的辅助手段,该研究还为以后应用S-层蛋白进行细菌表面展示、将S-层蛋白应用到纳米科学打下基础。