猪繁殖与呼吸综合征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome,PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus PRRSV)引起的一种以母猪繁殖障碍和仔猪呼吸道疾病为特征的传染病。我国1996年才报道有PRRS流行,目前流行的范围日益扩大,对养猪业构成了严重威胁。快速、特异且敏感的诊断方法对本病的控制已成为迫切需要。PRRSV为正链的单股RNA病毒,基因组长15kb,含有8个开放阅读框。核衣壳蛋白N蛋白由ORF7基因编码,该蛋白在全病毒中含量最高,免疫原性最强,是病毒感染后最早诱导产生特异性非中和抗体的蛋白。因此,PRRSV N蛋白在病毒的早期诊断和致病免疫机理研究中具有重要意义。本研究对GenBank中登录的PRRSV中国大陆分离株的N蛋白进行了遗传变异分析,在此基础上,利用原核表达系统对我国优势流行毒株ORF7基因进行了高效可溶性表达,并用重组的N蛋白作为抗原,建立了检测猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体的间接ELISA方法。主要研究内容包括：1PRRSV中国大陆分离株的N蛋白的遗传变异分析选取GenBank中登录的PRRSV中国大陆分离株的N蛋白进行了氨基酸序列分析和进化树分析,结果表明中国大陆所有已登录的256株PRRSV分离株分为欧洲型和美洲型两个基因型,大多数为美洲型毒株,其又可以分为4个不同的亚型;序列比对分析表明,各亚型毒株的氨基酸位点发生了特征性的突变,且N蛋白中的抗原表位也存在氨基酸的置换,表明我国PRRSV N蛋白存在遗传多样性的特点。2我国优势流行毒株N蛋白的原核表达针对我国优势流行毒株ORF7基因序列,设计了特异性引物,对其进行扩增与克隆,构建重组表达质粒pET-28a-N。将重组质粒pET-28a-N导入大肠杆菌BL21(DE3)用IPTG进行诱导表达,结果表达出大小约为22kDa的重组蛋白。经Western-Blot分析,该表达产物能与PRRSV阳性血清反应,具有良好的反应原性,说明PRRSV N蛋白在原核系统中获得了有效表达。3PRRSV N蛋白间接ELISA检测方法的建立与应用用纯化的N蛋白作包被抗原,通过优化反应条件,建立了检测猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体的间接ELISA方法。实验结果表明：抗原的最适包被浓度为2.23μg/mL,血清最适稀释度为1：200,最佳血清反应时间确定为37℃1h,二抗反应时间确定为37℃1h,底物显色液的最佳反应时间为5min,阴阳性临界值为0.395。所建立的间接ELISA方法具有良好的特异性和重复性.利用所建立的N-ELISA方法与IDEXX-ELISA检测试剂盒对来自不同地区的192份临床血清样品进行比较,结果显示所建立的间接ELISA方法与IDEXX-ELISA检测试剂盒有较好的符合性,且具有较高的特异性和敏感性.