硫是生物体内一种重要的元素。硫化氢(H2S)是一种具有臭鸡蛋气味的有毒气体,是酵母代谢过程中的重要产物。在哺乳动物中,H2S抑制呼吸链的功能从而影响动物呼吸系统和中枢神经系统的正常功能。在微生物中硫化氢可以抑制细胞色素c的功能,影响生物正常代谢。近年来,发现很多生物体可以内源性产生H2S,暗示H2S在体内具有一定的生理作用。近几年的研究发现,H2S是继CO和NO之后的第三类气体信号分子,在体内发挥相当重要的作用。H2S参与调控血管舒张,抗血压,抗炎症和氧化,抵抗凋亡保护细胞,抑制机体代谢;机体硫化氢代谢异常还会引起胚胎转运异常(俗称宫外孕)。硫化氢在大肠杆菌和金黄色葡萄球菌中可以抵抗外界的氧化压力,维持胞内正常的氧化还原环境。在酿酒酵母中,硫化氢作为菌间信号分子参与调控次昼夜代谢震荡。硫化氢可能是通过将蛋白的巯基过硫化修饰,影响蛋白的功能,进而调控相关代谢。目前普遍认为,在体内起调控作用的是活性硫基团(reactive sulfur species,RSS),而不是硫化氢,RSS中的硫原子是硫烷硫(sulfane sulfur),更活泼,更易于和靶位点结合。在哺乳动物细胞中,胱硫醚β合成酶(CBS),胱硫醚γ裂解酶(CSE)和3-巯基丙酮酸转移酶(3-MST)催化途径可以生成硫化氢。在微生物体内,除CBS,CSE和3-MST外,亚硫酸盐还原酶也是产生硫化氢的重要途径。目前发现最普遍的硫氧化系统是硫醌氧化还原酶(SQR),过硫化物双加氧酶(PDO)和硫转移酶(ST)系统。SQR将硫化氢氧化成多硫化物,多硫化物与谷胱甘肽(GSH)反应,生成谷胱甘肽过硫化物(GSSH),然后被PDO氧化成亚硫酸盐。GSSH和多硫化物可以与亚硫酸反应生成硫代硫酸盐。ST可以加速GSSH与亚硫酸盐反应生成硫代硫酸盐,亦可以催化多硫化物与GSH反应生成GSSH。人体的Tstd1和酵母的Rdl1还可以催化硫代硫酸盐的降解。人体红细胞可以通过铁离子氧化硫化氢,保证血液中硫化氢浓度维持在合适的浓度。过氧化氢酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)以及肌红蛋白也可以氧化硫化氢,降低机体内硫化氢的浓度。在微生物中,主要是通过SQR/PDO/ST系统氧化硫化氢。最新研究发现黄色素c硫化物脱氢酶(FCSD)系统也可以氧化硫化氢。硫化氢氧化的过程中,SQR可以产生大量硫烷。SOD,CAT和肌红蛋白在氧化硫化氢的过程也产生硫烷。CBS,CSE和3-MST可以催化半胱氨酸产生半胱氨酸过硫化物,也是产生硫烷的重要途径。最近发现,半胱氨酰-tRNA合成酶可以催化半胱氨酸产生半胱氨酸过硫化物,在体内也具有重要的作用。不同酿酒酵母菌株硫化氢的产量差异很大,范围在0～290 μg/L,远远高于人体。硫元素在酵母胞内的主要形式是半胱氨酸和GSH,GSH在酵母胞内浓度最高可达10 mM。酵母可以直接吸收半胱氨酸也可以同化硫酸盐合成半胱氨酸用于正常的细胞代谢。酵母通过Yct1吸收半胱氨酸,当胞外硫源不足时,YCT1的表达量会显著上调。硫酸盐通过Sul1和Sul2进入酵母细胞,被同化成硫化氢,然后用于合成半胱氨酸。Sul1和Sul2功能冗余,缺失任意一个都不影响硫酸盐的同化。当胞外硫源不足时,二者的mRNA水平急剧增加。Sul1和Sul2还可以感知胞外硫酸盐的浓度,是首次被发现的转运感知蛋白(transceptor),可以激活胞内的PKA途径。硫酸盐进入到胞内后,经过ATP硫酸化酶(Met3)活化成5-磷酸硫酸腺苷(adenosine 5’-phosphosulfate,APS),再经过 APS 激酶(Met14)磷酸化,转变成3-磷酸腺苷硫酸盐(3’-phosphoadenylsulfate,PAPS),上述两步各需要消耗1分子ATP。PAPS还原酶(Met16)消耗1分子NADPH,将PAPS还原成亚硫酸盐,再经过亚硫酸盐还原酶(Met5、Met10)还原成硫化氢。酿酒酵母中不存在丝氨酸乙酰转移酶活性,所以不存在乙酰丝氨酸,是由半胱氨酸合成酶(Met15)催化硫化氢和乙酰高丝氨酸,生成同型高半胱氨酸。然后经过胱硫醚β合成酶(Cys4)转换成胱硫醚,再经过胱硫醚γ裂解酶(Cys3)催化,生成半胱氨酸。硫代硫酸盐在环境中广泛存在,是多种硫氧化细菌的硫氧化产物,种过植被的土壤上层浓度可以达到150 μM。酿酒酵母也可以同化硫代硫酸盐,用来合成半胱氨酸。酿酒酵母以硫代硫酸盐作为硫源进行发酵时,可以产生更多的生物材料,是一种很好的硫源。目前酵母中硫化氢和硫烷研究甚少,且酵母如何同化硫代硫酸盐也有待研究。本文主要以酿酒酵母为研究对象,研究了酵母中硫化氢的代谢和硫化氢的功能,同化硫代硫酸盐合成半胱氨酸以及酵母对硫代硫酸盐的耐受性。(1)酵母中硫化氢的代谢及功能通过醋酸铅试纸条和SSP4检测酿酒酵母中硫化氢和硫烷的浓度变化,研究硫化氢和硫烷在酿酒酵母的功能。酿酒酵母两个菌株BY4741和BY4742硫化氢的累积量不同,可能是因为BY4741的半胱氨酸合成酶(Met15)缺失,不能消耗硫化氢,导致更多的硫化氢累积。BY4741菌株在富含硫酸盐的SD培养基中硫化氢的产量远高于在YPD丰富培养基中,而且敲除亚硫酸盐还原酶后,酵母的硫化氢产量显著下降,说明在酿酒酵母中硫酸盐同化途径是合成硫化氢的主要途径。在BY4741菌株中外源表达来自粟酒酵母的SQR和人体的PDO,酵母不再累积硫化氢,说明不同硫氧化系统可以组合到一起在酵母中发挥作用。硫化氢主要在酵母即将进入稳定期时产生,在生长前期基本没有硫化氢累积。用SSP4探针检测发现酵母胞内存在丰富的硫烷硫,在胞内均匀分布,不存在明显的亚细胞器定位;并且胞内的硫烷浓度在生长前期很高,随着生长逐渐降低。硫化氢的累积与胞内硫烷的浓度呈现负相关的关系,可能是由于酵母后期胞内还原力冗余,将硫烷还原成硫化氢,然后释放到胞外。敲除亚硫酸盐还原酶(Met5)后,酵母对铜离子和锌离子的耐受性显著提高,而且Met5缺失株胞内累积更少的铜离子。外源表达SQR和PDO后,酵母对重金属的耐受性也显著改变。由此可知,硫化氢和硫烷与酵母对重金属的耐受性息息相关,具体机制仍需要继续研究。(2)硫转移酶参与酵母同化硫代硫酸盐由于硫代硫酸盐和硫酸盐具有类似的结构,本研究参照硫酸盐的代谢,对酵母进行一系列的基因操作,发现了酵母同化硫代硫酸盐的路径。较之硫酸盐,酵母BY4742以硫代硫酸盐为硫源时,生长速率更快,乙醇产量更高,说明硫代硫酸盐是一个很好的硫源。酵母通过Sul1,Sul2和Soal吸收硫代硫酸盐,然后经过胞内的硫转移酶(Rhodanese,Rhod):Rdl1,Rdl2,Tum1和Ychl催化,以GSH作为辅酶,生成亚硫酸盐和硫化氢。亚硫酸盐通过亚硫酸盐还原酶转变成硫化氢。半胱氨酸合成酶(Met1 5)催化硫化氢与乙酰高丝氨酸反应,生成高半胱氨酸,然后经过胱硫醚β合成酶(Cys4),胱硫醚Y裂解酶(Cys3)催化,生成半胱氨酸。不同于大肠杆菌的CysM,Met15不能直接催化硫代硫酸盐与乙酰高丝氨酸反应,只能以硫代硫酸盐代谢的产物硫化氢为底物。通过序列分析发现,CysM的同源蛋白主要存在于细菌,不存在于真菌中。Met15的同源蛋白主要在真菌中分布,且与大肠杆菌CysK的进化关系更近。该结果暗示真菌可能通过与酵母类似的代谢路径利用硫代硫酸盐。对于不含有CysM类型的半胱氨酸合成酶的微生物,可以用类似于酵母的半胱氨酸合成酶合成系统利用硫代硫酸盐当酵母胞外硫源不足时,SUL和SUL2的表达量会显著上调;加入硫代硫酸盐后,mRNA水平急剧降低,转运能力也会迅速下降。敲除5UL1和SUL2后,加入硫代硫酸盐仍然能激活酵母的PKA途径,说明酵母存在其他感应胞外硫代硫酸盐的感知蛋白。Rhod可以催化硫代硫酸盐和GSH反应,推测是通过乒乓机制,中间伴随着过硫化物的生成。除GSH外,Rdl2可以选择半胱氨酸,DTT和辅酶A作为硫受体,最终生成硫化氢。Rdl1对酵母同化硫代硫酸盐起主要作用,敲除后利用硫代硫酸盐的能力下降,再敲除其他Rhod后,表型更明显。通过实验发现,利用硫代硫酸盐的能力:Wt>Δrdl1>Δrdl1Δrdl2>Δrdl1Δrdl2Δtum1Δych1。在敲除4个Rhod的菌株中表达来自其他菌株的Rhod时,皆可恢复酵母利用硫代硫酸盐的能力。硫代硫酸盐的同化路径与硫酸盐的同化路径高度重合,只是需要额外的Rhod参与。由于Rhod分布广泛,只要可以同化硫酸盐的生物都可以同化硫代硫酸盐,额外需要的仅是一个Rhod。硫代硫酸盐含有一个硫烷硫原子,产生硫化氢仅需要一个NADPH,而硫酸盐生成硫化氢需要2个ATP和4个NADPH。因此微生物在环境中可能更倾向于利用硫代硫酸盐作为硫源。硫代硫酸盐在环境中广泛存在,因为异养细菌可以将硫化氢氧化成硫代硫酸盐,也可以将硫代硫酸盐氧化成硫酸盐。由于硫代硫酸盐比硫酸盐消耗更少的能量,在工业发酵中,硫代硫酸盐可能是一个更好的选择。(3)酵母对硫代硫酸盐的耐受性与亚硫酸盐相比,硫代硫酸盐多含有一个硫烷硫原子,寻找硫代硫酸盐作用靶位点时可以参照亚硫酸盐。而且Rhod可以降解硫代硫酸盐,因此推测酵母中的Rhod与酵母对硫代硫酸盐的耐受性有关,后续的研究都是基于Rhod突变株。酿酒酵母BY4742可以有效地利用硫代硫酸盐,但是过量的硫代硫酸盐会对酵母产生毒性,且毒性要明显高于亚硫酸盐。培养基pH越低,酵母对硫代硫酸盐的耐受性越低。硫代硫酸盐在低pH条件下会引起酵母细胞裂解,杀死酵母细胞,而在高pH条件下仅抑制酵母细胞生长。在SD培养基中,酵母培养液最终pH可以达到2.1,仍然存在大量的硫代硫酸盐,且在pH3.4的缓冲液中硫代硫酸盐基本不降解,说明在低pH条件下,硫代硫酸盐直接作用于酵母细胞。Rdl1体外可以降解硫代硫酸盐,敲除RDL1后,酵母对硫代硫酸盐十分敏感,再敲除RDL2后,对硫代硫酸盐的耐受性会更低。但是敲除RDL2基本不影响酵母对硫代硫酸盐的耐受性,说明硫代硫酸盐对酵母的毒性主要由Rdl1解除。Rdl1和Rdl2贡献了酵母主要的硫转移酶活性。由此可知,酵母通过Rhod降解硫代硫酸盐获得对硫代硫酸盐的耐受性。在Δrdl1菌株中外源表达其他物种的Rhod并不能恢复酵母对硫代硫酸盐的耐受性。Rdl1定位于线粒体,而且添加硫代硫酸盐会抑制酵母的氧气消耗,因此推测硫代硫酸盐的靶位点是线粒体。Rdl1和Rdl2既可以催化硫代硫酸盐与GSH反应,生成GSSH和亚硫酸盐,又可以加速GSSH和亚硫酸盐反应生成硫代硫酸盐。而且大肠杆菌的PspE和GlpE也可以催化该双向反应,说明Rhod可以影响硫代硫酸盐的降解与合成。硫代硫酸盐在环境中广泛分布,是重要的硫代谢产物,因此Rhod在自然环境的硫循环中可能发挥十分重要的作用。