靶向EP2受体的丹参酮ⅡA纳米粒调控β-arrestin1抑制大肠癌侵袭转移的机制研究

来源 :上海中医药大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:pie1011
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目的:首先,课题组建立具有水溶性好、主动靶向EP2受体的丹参酮ⅡA纳米粒(以下简称EP2-TSⅡA-NP)。之后,检测EP2-TSⅡA-NP的表征,并探讨其对大肠癌Lo Vo细胞的影响和对裸鼠皮下移植瘤模型治疗作用。从而初步探讨EP2-TSⅡA-NP靶向EP2受体抑制大肠癌侵袭转移的作用机制。方法:1、采用免疫组化法检测大肠癌组织、癌旁组织、肺转移组织、肝转移组织细胞胞膜EP2受体特异性表达情况。通过Western Blot筛选出大肠癌EP2受体高表达细胞株Lo Vo细胞。运用EP2受体激动剂(Butaprost)、抑制剂(PF-04418948)、PGE2作用于大肠癌Lo Vo细胞,采用Werstern blot检测EP2、β-arrestin1(total)、β-arrestin1(nuclear)、MMP9蛋白表达情况,探讨EP2受体对β-arrestin1调控情况。2、采用CCK-8法观察丹参酮ⅡA(Tanshinone ⅡA,以下简称TSⅡA)对大肠癌Lo Vo细胞的细胞毒性,划痕实验测定TSⅡA对大肠癌Lo Vo细胞迁移能力的影响。3、通乳化溶剂蒸发法,将TSⅡA制成能够EP2-TSⅡA-NP(靶向EP2受体的丹参酮ⅡA纳米粒)。通过电镜、Zeta电位对EP2-TSⅡA-NP进行表征分析检测。4、体外抗肿瘤实验:采用CCK-8比较EP2-TSⅡA-NP与TSⅡA对大肠癌Lo Vo细胞的细胞毒性。采用荧光分析技术测定EP2-TSⅡA-NP对大肠癌Lo Vo细胞靶向作用情况。采用划痕实验比较EP2-TSⅡA-NP与TSⅡA对大肠癌Lo Vo细胞的迁移能力的影响。5、将大肠癌Lo Vo细胞分成6组分别给药:对照组、TSⅡA组、TSⅡA纳米粒组(TSⅡA-NP组)、EP2-TSⅡA-NP组、空纳米粒组(NP组)、阳性对照组(EP2受体抑制剂PF-04418948组,以下简写EP2),Western Blot检测EP2-TSⅡA-NP对人肠癌Lo Vo细胞中EP2、β-arrestin1(total)、β-arrestin1(nuclear)、MMP9蛋白的调控作用,从而探究EP2-TSⅡA-NP抑制大肠癌侵袭转移的部分作用机制。6、体内抗肿瘤实验:建立裸鼠皮下移植瘤模型并随机分成6组分别经尾静脉注射给药:对照组;TSⅡA组;TSⅡA-NP组;EP2-TSⅡA-NP组;NP组;EP2组。隔天给药,比较治疗后各组裸鼠的肿瘤生长情况、肿瘤坏死程度和生存时间,检测肿瘤组织中EP2、β-arrestin1(total)、β-arrestin1(nuclear)、MMP9蛋白的表达,以探讨EP2-TSⅡA-NP对大肠癌靶向治疗效果。结果:EP2受体在大肠癌原发灶及转移灶细胞胞膜上能够特异性表达,通过调控EP2受体,发现EP2受体可能通过促进β-arestin1入核,上调MMP9的表达,进而引起大肠癌细胞的侵袭转移的发生。细胞毒性实验表明,TSⅡA具有细胞毒性,划痕实验表明,TSⅡA能够抑制大肠癌Lo Vo细胞迁移能力,从而抑制大肠癌Lo Vo细胞的侵袭转移。成功构建EP2-TSⅡA-NP,其溶解度明显提高,电镜下观察EP2-TSⅡA-NP粒径分布均匀,粒径大小约为180nm±9.8nm,形态规则呈球状;Zeta电位分析仪分析EP2-TSⅡA-NP的Zeta电位为30m V,说明EP2-TSⅡA-NP的稳定性良好。体外实验中,EP2-TSⅡA-NP与TSⅡA相比,对细胞毒性更大;运用荧光分析技术发现,EP2-TSⅡA-NP具有良好的靶向EP2的作用,说明EP2-TSⅡA-NP能够靶向EP2,从而更好的抑制大肠癌细胞的侵袭转移。在体内实验中,通过比较各组皮下移植瘤瘤体体积、瘤重,肿瘤生存期,EP2-TSⅡA-NP效果显著。Western Blot蛋白检测表明,与其他各组相比,EP2-TSⅡA-NP可能通过靶向EP2受体,抑制β-arrestin1入核,下调MMP9蛋白表达水平从而发挥抑瘤作用。结论:与TSⅡA相比,EP2-TSⅡA-NP具有良好的溶解性,靶向性和缓释性,对大肠癌具有更好的治疗效果,延长荷瘤裸鼠的生存期。EP2-TSⅡA-NP抑制大肠癌侵袭转移的机制可能通过靶向EP2受体,抑制β-arrestin1入核,下调MMP9蛋白表达从而抑制大肠癌的侵袭转移。
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