[研究目的]卵巢癌是女性生殖系统中死亡率最高的肿瘤性疾病,恶性程度高且预后差,化疗及手术治疗后约70%的患者会复发。卵巢癌的复发与手术及化疗后残存的肿瘤细胞中具有干细胞特性的肿瘤细胞的增殖状态转换相关,且复发的肿瘤多表现出较强的耐药性,普通化疗方式难以取得理想效果。卵巢癌的靶向治疗一直是研究的热点,有效的靶向治疗需要选择适宜的靶点和靶向作用途径。胰岛素样生长因子1受体(Insulin-like Growth FactorReceptor1,IGF-1R)在肿瘤细胞增殖和抗凋亡中发挥重要作用,是肿瘤复发的重要因素之一。纳米载药系统介导的靶向治疗可以通过被动和主动双重靶向,实现化疗药物在肿瘤细胞内的富集,大大提升化疗效果。中空介孔二氧化硅(Hollow Mesoporous SilicaNanoparticles,HMSN)具有良好的生物相容性,较大比表面积,孔道均匀且多孔结构稳定等优点,是理想的纳米载药材料。本研究以IGF-1R为靶点,利用HMSN负载NVP-AEW541(IGF-1R特异性的阻断剂)、阿霉素(Doxorubicin,DOX)构建复合系统,初步探究HMSN复合载药系统靶向阻断IGF-1R抑制卵巢癌干细胞样细胞CD117+CD44+A2780增殖和抗凋亡的作用,为延长卵巢癌患者的缓解期提供新的研究思路及方向。[研究方法]1.采用细胞免疫组化法检测本次实验所使用的卵巢癌细胞株CD117+CD44+A2780中IGF-1,IGF-2,IGF-1R 的表达。将细胞与不同浓度的 IGF-1(10ng/ml,25ng/ml,40ng/ml,55ng/ml)共培养筛选出适宜的IGF-1浓度。根据不同的处理方式将实验分为:IGF-1刺激组,NVP抑制组和空白对照组,通过流式细胞术检测三组中IGF-1R的表达,细胞周期的分布和细胞凋亡率,以及细胞与药物共孵育24小时后,通过Western Blot技术检测IGF-1刺激组,NVP抑制组和空白对照组中细胞周期蛋白B1的表达;2.采用红外光谱仪,高分辨透射电镜,扫描电镜,激光粒度分析仪对HMSN-COOH@DOX fluorescence NVP复合载药系统进行物理表征。计算DOX、NVP-AEW541的载药量和包封率,并将载药HMSN分散在不同PH值(4.5,5.5,6.5,7.4)的PBS中,分别计算DOX和NVP-AEW541的释放率;3.将实验分为 HMSN-COOH@DOX fluorescence NVP 组,HMSN-COOH@DOX 组和游离药物对照组。激光共聚焦观察纳米载药系统在胞内的累积。流式细胞术检测三组的细胞凋亡率,MTT检测三组的细胞抑制率;Western Blot检测三组中凋亡相关蛋白Bax,Bcl-xl,P-akt的表达情况;4.用spss19.0统计软件,检测数据以均数±标准差(Mean±SD)表示,两组数据比较采用t检验,以P≤0.05时作为有统计差异的标准。[研究结果]1.卵巢癌细胞株CD117+CD44+A2780的细胞膜和细胞质中均有褐色颗粒,表明IGF-1,IGF-2和IGF-1R在此细胞株中表达。细胞计数筛选出IGF-1的适宜浓度为40ng/ml。IGF-1刺激组的IGF-1R表达量明显高于NVP抑制组(P≤0.05)。IGF-1刺激组较空白组处于S期的细胞显著增加(P≤0.05),G2期的细胞明显减少(P≤0.05),NVP抑制组与其他两组相比更多的细胞被阻滞在G2/M期(P≤0.05)。细胞凋亡结果显示,48小时后IGF-1刺激组(6.53±0.36)%与空白对照组(8.38±0.25)%的细胞凋亡率间的差异具有统计学意义(P≤0.05);NVP抑制组的细胞凋亡率为(32.79±0.34)%,与空白对照组和IGF-1抑制组间均有显著差异(P≤0.05)。三组中IGF-1刺激组的细胞周期蛋白CyclinB1表达量明显高于空白对照组和NVP抑制组(P≤0.05),同时NVP抑制组的CyclinB1表达量显著低于空白对照组和IGF-1刺激组(P≤0.05)。2.红外光谱仪可证实羧酸已被修饰在HMSN表面,在PH值逐渐降低的过程中HMSN-COOH所带电荷发生反转。通过扫描电镜和透射电镜均可发现负载药物的HMSN的形态和粒径未发生明显改变。DOX的包封率约为37%,载药量约为6.17%,NVP的包封率约为44%,载药量约为2.10%。DOX和NVP的释放率均随着溶液PH值的降低而升高,表现出明显的PH敏感性。3.通过激光共聚焦观察发现此复合纳米载药系统可随着时间的延长逐渐在细胞内富集。HMSN-COOH@DOX fluorescence NVP 组的凋亡率较 HMSN-COOH@DOX 组的凋亡率显著升高(P≤0.05),与游离对照组相比经HMSN运载后,NVP联合DOX的杀伤作用要明显强于直接使用两药(P≤0.05)。HMSN-COOH@DOX fluorescence NVP组的细胞抑制率大于其他两组的抑制率(P≤0.05)。Western Blot结果显示HMSN-COOH@DOX fluorescence NVP 组较 HMSN-COOH@DOX 和游离对照组 Bax 蛋白的表达量显著增高(P≤0.05),同时Bcl-xl和P-akt蛋白的表达量明显降低(P≤0.05)。[结论]1.IGF-1,IGF-2 和 IGF-1R 均在 CD117+CD44+A2780 细胞株中表达,IGF-1 可有效的刺激CD117+CD44+A2780细胞增殖,增强肿瘤细胞抗凋亡的能力,NVP-AEW541则可将细胞阻滞在G2/M期,促进肿瘤细胞凋亡。2.HMSN-COOH在PH值逐渐降低的过程中发生质子化,所带电荷由负电荷反转为正电荷。HMSN负载的DOX和NVP-AEW541有较高的包封率,在酸性环境中具有较高的释放率。3.HMSN-COOH@DOX fluorescence NVP 通过主动亲和 IGF-1R 阻断 IGF 信号轴并将所负载的药物高效释放在胞内,可抑制卵巢癌干细胞样细胞的增殖抗凋亡。4.纳米载药系统HMSN-COOH@DOX fluorescence NVP通过进一步的在体实验有可能成为新型的化疗药物,提高化疗效果的同时降低药物的毒副作用。