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产气荚膜梭菌引起的“猝死症”给养殖业的发展带来了巨大的经济损失,针对其毒素致病机制制备类毒素疫苗是免疫预防的关键。本研究利用A型产气荚膜梭菌标准株,在山东省动物用免疫佐剂工程技术中心,采用全自动机械搅拌发酵罐对毒素的生产发酵进行了详细的研究,利用其发酵产物制备了类毒素油乳剂疫苗并对家兔的免疫效果进行了检测,与灭活的全菌体疫苗(简称灭活菌苗)的免疫效果进行了比较。结果表明pH7.0,43℃,经6h发酵能够获得含较高浓度的α毒素的发酵液;制备的类毒素油乳剂苗免疫效果好,明显优于灭活菌苗。本研究分为三部分:第一部分:A型产气荚膜梭菌α-毒素生产发酵工艺的研究设立温度、pH值和发酵时间3个因素,采用L9(34)正交优化设计方法,通过全自动机械搅拌发酵罐进行发酵,确定各因素对A型产气荚膜梭菌产α毒素的影响程度,并绘制发酵过程细菌生长曲线和产毒曲线。结果表明,pH值对细菌的产毒量影响显著(0.01<P<0.05),发酵时间、温度对细菌产毒量影响不显著(P>0.05)。确定出以pH7.0,43℃,经6h发酵作为A型产气荚膜梭菌α毒素生产发酵工艺条件。第二部分:A型产气荚膜梭菌类毒素油乳剂苗的研制及免疫效果的研究利用全自动机械搅拌发酵罐对A型产气荚膜梭菌进行发酵培养生产毒素,毒素经0.4%的甲醛灭活制备了类毒素油乳剂疫苗。根据兽用生物制品规程对类毒素疫苗进行物理性状、安全性等常规检测,并对疫苗的抗体消长规律、保护率以及与商品化的灭活菌苗免疫效果进行了比较。结果表明,用甲醛灭活48h后制备的类毒素油乳剂疫苗经检验符合疫苗制造的各项要求,对动物安全性高,无毒副作用;2mL免疫家兔获得了100%的保护率;免疫家兔后第4周平均抗毒素效价和抗菌效价达到最高峰,分别为8.3log2和8.6log2,到19周抗毒素和抗菌效价分别为6.5log2和5.4log2;免疫后攻毒第2～19周均达到100%的保护率。通过比较,类毒素疫苗和灭活菌苗产生的抗菌效价水平差异不显著(P>0.05),类毒素疫苗产生抗毒素效价水平明显高于灭活菌苗(P<0.05),动物安全性以及对动物保护率均优于灭活菌苗。可见本疫苗对动物具有确实可靠的免疫效果。第三部分:A型产气荚膜梭菌α-毒素纯化方法改进的研究本试验采用60%的饱和硫酸铵对A型产气荚膜梭菌外毒素蛋白进行盐析,经过透析脱盐后,采用Amicon Ultra-15超滤离心管对粗提的蛋白进行两次超滤纯化,通过纯化前后毒素蛋白含量测定以及SDS-PAGE中蛋白的含量,确定了使用Amicon Ultra-15超滤离心管纯化α-毒素蛋白能够获得较高的纯度,其含量约为粗提蛋白含量的1/5。