1、研究背景及目的Wilson病(Wilson’s disease,WD)又称肝豆状核变性(hepatolenticular degeneration,HLD),是一种常染色体隐性遗传的铜代谢障碍性疾病。本病患者由于体内铜蓝蛋白(Ceruloplasmin,CP)合成障碍以及胆汁铜的排泄障碍,过量的铜沉积于肝、脑、角膜等脏器组织,引起相应脏器功能障碍,临床以肝损害症状、神经/精神症状、双眼角膜Kayser-Fleischer环(K-F环)、肾功能损害为主要表现,严重者可危及生命。研究表明,肝脏是WD最先受累的脏器之一,发病年龄越小,以肝病为唯一表现的可能性越大。患者由于ATP7B基因突变导致ATP7B功能出现缺陷,不能清除体内多余的铜,肝脏、大脑、肾等器官和组织(尤其肝脏和脑组织)中出现大量的铜沉积。体内过多的铜诱导自由基反应和脂质过氧化反应,损伤肝细胞,引起脂肪变性和炎症,导致肝细胞死亡。肝细胞死亡后将铜释放入血浆而导致溶血和肝外组织铜沉积,引起受累器官或系统的结构和功能受损而致病变:如慢性肝炎、肝硬化而导致肝功能衰竭。研究表明,肝细胞凋亡在所有肝病中均存在,持续不规律性肝细胞凋亡是WD肝损伤的重要原因。最新研究表明,Mi RNA调控着人类近三分之一的基因,可以转录水平调控靶基因表达,细胞的发生、分化、增殖、凋亡均受mi RNA调控。Mi RNA-122在肝脏中特异性高度表达。Mi RNA通过靶向调控凋亡因子直接间接的影响的肝细胞凋亡进程。代谢组学自诞生以来在生命科学多个领域快速发展,为研究中医药理论与疗效评价等关键问题提供了研究方法。肝脏是人体代谢的中心器官,参与机体合成、分解、转化、排泄。代谢组已经在病毒性肝炎、肝硬化、肝癌、肝衰竭中进行了相关的研究。但WD中肝脏的代谢组可能与其它肝病的代谢谱不尽相同,因此WD肝脏的代谢组学研究对WD的相关机制研究尤为重要。前期对WD患者的研究中发现,以肝病起病的患者多表现为无任何临床症状的肝功能异常和肝硬化,甚则以急性肝衰竭起病。导师所领导的课题组在临床及实验研究中已经证明:中药复方肝豆灵可以在促进WD患者排铜的同时保护肝脏,促进肝损伤的恢复。本实验主要开展以下研究:建立铜负荷大鼠模型,观察肝豆灵对肝组织ALT、AST、TBIL、血清铜、肝铜、肝脏病理的影响,应用TUNEL法检测肝细胞凋亡和免疫组化法检测了NF-KB、Caspase-3、Bcl-2、Bax的影响,运用RT-PCR检测了肝组织中mi RNA-122的表达,进一步应用代谢组技术检测了肝豆灵对铜负荷大鼠肝组织小分子代谢谱的变化,探讨肝豆灵治疗WD肝损伤的分子机制。2.方法2.1实验分为4组:分别为正常组、模型组、青霉胺组、肝豆灵组;2.2按照文献复制铜负荷大鼠模型;2.3使用肝豆灵对中药组大鼠进行干预,选用青霉胺为阳性对照药;2.4血清ALT、AST、TBIL由全自动生化仪测定,原子吸收法检测血铜、肝铜;2.5应用TUNEL法检测肝细胞凋亡,免疫组化法检测NF-KB、Caspase-3、Bcl-2、Bax的表达2.6运用RT-PRC法检测肝组织中mi RNA-122的表达;2.7应用UPLC-MS技术检测WD肝损伤大鼠肝组织小分子代谢谱的变化。3.结果3.1肝豆灵对铜负荷模型大鼠血清铜和肝铜的影响与正常组比较,模型组血清铜、肝铜含量明显升高(P<0.01),提示铜负荷大鼠体内存在铜蓄积,造模成功;与模型组比较,青霉胺组、肝豆灵组血清铜、肝铜水平显著降低(P<0.01);青霉胺血清铜、肝铜水平低于肝豆灵水平(P<0.05)。以上结果显示,肝豆灵具有一定的排铜作用,但弱于青霉胺。3.2肝豆灵对铜负荷大鼠肝功能的影响各组大鼠肝功能比较:与正常组比较,模型组ALT、AST、TBIL水平显著升高(P<0.01);与模型组比较,青霉胺组和肝豆灵组ALT、AST、TBIL水平显著降低(P<0.01);肝豆灵组ALT、AST和TBIL水平显著低于青霉胺组(P<0.05,或P<0.01)。3.3肝豆灵对铜负荷大鼠肝组织病理的影响HE染色结果显示,正常组大鼠肝组织中肝小叶结构清晰,肝细胞围绕中央静脉和汇管区有序排列,肝细胞界限明显,大小基本相同;模型组大鼠肝组织中可见肝小叶结构紊乱,肝细胞界限不清,细胞核消失、固缩。用药两组均较模型组肝损伤程度减轻。3.4肝豆灵对铜负荷大鼠肝细胞凋亡的影响正常组未见肝细胞表达,模型组可见大量凋亡棕褐色肝细胞表达,各治疗组可见棕黄色梭型肝凋亡细胞的表达,模型组较正常组肝凋亡细胞数明显增多(P<0.01),各治疗组肝细胞凋亡指数较模型组明显降低,肝豆灵组和青霉胺组相比有差异(P<0.05)。3.5肝豆灵对Caspase-3、Bcl-2、Bax、NF-KB的影响与正常组相比,模型组可见大量棕褐色或棕黄色阳性细胞表达,各治疗组可见棕褐色或棕黄色阳性细胞表达,模型组阳性细胞数较正常组表达明显升高(P<0.01),各治疗组阳性细胞数较模型组显著降低(P<0.01),肝豆灵组和青霉胺组相比有差异(P<0.05)。3.6各组大鼠肝组织mi RNA-122表达水平比较与正常组比较,模型组mi RNA-122表达水平显著降低(P<0.01),与模型组比较,青霉胺组、肝豆灵组mi RNA-122表达水平显著升高(P<0.05,或P<0.01);肝豆灵组mi RNA-122表达水平显著高于青霉胺组(P<0.05)。3.7肝豆灵对铜负荷大鼠代谢组学的影响模型组中溶血磷脂酰胆碱(20:5、18:2、16:0、18:3、20:1、20:3)、油酸酰胺下降,显著下降,色氨酸、苯丙氨酸、硬脂酰胺、牛磺酸鹅脱氧胆酸、甘氨胆酸、牛磺胆酸显著上升。肝豆灵对提高溶血磷脂酰胆碱(20:5、18:2、16:0、18:3、20:1、20:3)、油酸酰胺的含量,降低色氨酸、苯丙氨酸、硬脂酰胺、牛磺酸鹅脱氧胆酸、甘氨胆酸、牛磺胆酸的含量。4.结论4.1本研究采用铜负荷法复制了铜过量大鼠模型,模型组可见铜过量后肝损伤病理改变,该模型可反映铜过量沉积导致肝损伤的病理。4.2本研究发现铜过量负荷大鼠模型可见ALT、AST、TBIL、血清铜和肝铜明显升高,各治疗组均较模型组下降,肝豆灵组ALT、AST、TBIL下降更明显,青霉胺组血清铜和肝铜低于肝豆灵组,提示肝豆灵对铜负荷大鼠有抑制肝损伤作用,排铜效果弱于青霉胺。4.3本研究发现铜过量负荷大鼠模型组凋亡细胞大量表达,各治疗组凋亡细胞较模型组降低,提示肝豆灵对铜负荷大鼠有抗肝细胞凋亡作用。4.4本研究发现模型组Caspase-3、Bcl-2、Bax、NF-KB阳性表达,各治疗组较模型组明显改善。提示铜负荷大鼠肝损伤时Caspase-3、Bcl-2、Bax、NF-KB被激活,参与了WD铜负荷大鼠肝损伤的发生、发展过程。肝豆灵可能通过对Caspase-3、Bcl-2、Bax、NF-KB的抑制作用发挥了保护肝脏改善肝损伤作用。4.5本研究发现模型组mi RNA-122含量明显降低,各治疗组较模型组明显升高,肝豆灵组升高较模型组明显。提示铜负荷大鼠肝损伤时mi RNA-122可能参与了WD铜负荷大鼠的肝损伤的发生发展,肝豆灵可能通过升高mi RNA-122发挥了保护肝脏改善肝损伤作用,mi RNA-122可作为肝损伤特异性指标,mi RNA-122可能通过Caspase-3、Bcl-2、Bax、NF-KB介导了肝细胞凋亡。4.6采用UPLC-MS的代谢组学方法研究了肝豆灵对铜负荷大鼠肝损伤大鼠肝组织干预作用,得到溶血卵磷酯、油酸酰胺、色氨酸、苯丙氨酸、硬脂酰胺、牛磺酸鹅脱氧胆酸、甘氨胆酸、牛磺胆酸等特征性代谢物,通过对这些代谢物的代谢途径分析发现,铜在肝组织中影响了脂代谢、氨基酸代谢、胆汁酸代谢,而肝豆灵保护肝脏改善肝损伤可能通过对这些代谢途径的调节,改善了异常的代谢途径,体现了中药复方治疗疾病具有多途径、多层次、多靶点的特点。