论文部分内容阅读
本课题为导师广东省科技计划项目（项目名称:新型声敏剂二氢卟吩e6的声敏纳米脂质体给药系统及肿瘤局部药动学研究;项目编号:2014A020210022）的药效研究部分,课题组前期研究已确定了二氢卟吩e6磁性声敏纳米脂质体的处方和制备工艺,基于此,本研究首次建立二氢卟吩e6磁性声敏纳米脂质体（Ce6/SML）声动力靶向给药系统,并研究其体内外抗肿瘤活性。此给药系统给药后,脂质体可以实现二氢卟吩e6的持续释放,并在外加磁场的作用下将磁性声敏脂质体引导到肿瘤部位,当肿瘤部位脂质体聚积后,超声处理实现脂质体中二氢卟吩的靶向释放,并利用超声激活二氢卟吩e6。一、目的本课题为提高二氢卟吩e6的肿瘤靶向性从而增强其肿瘤杀伤作用,以磁性声敏脂质体作为药物载体,外加超声作为磁性声敏脂质体的释药条件及二氢卟吩e6的激发条件,成功建立二氢卟吩e6磁性声敏纳米脂质体（Ce6/SML）的声动力靶向给药系统并验证其可行性,包括:1.外加磁场对磁性脂质体的磁靶向作用;2.脂质体对二氢卟吩e6的缓释作用;3.超声对脂质体的靶向释放作用;4.超声对二氢卟吩e6的活性激活作用。药效学研究方面包括体内外抗肿瘤实验,以及超声结合Ce6/SML对肿瘤组织中CAT、SOD、GSH-PX酶活性,VEGF和ANG蛋白表达、血清肿瘤因子TNF-α表达的影响。二、方法1.二氢卟吩e6分析方法的建立建立二氢卟吩e6的高效液相检测方法,包括色谱条件的确定,标准曲线的绘制,线性范围的考察,精密度试验,稳定性试验,定量限及检测限的测定。2.二氢卟吩e6磁性声敏纳米脂质体（Ce6/SML）的制备和质量评价以蛋黄卵磷脂和胆固醇为脂质体材料,采用薄膜分散-真空冷冻干燥技术制备二氢卟吩e6磁性声敏纳米脂质体。测定其包封率、载药量、粒径形态并对其声敏特性进行评价。3.二氢卟吩e6磁性声敏纳米脂质体的细胞毒性试验和细胞酶活性试验以A549肺癌细胞为研究对象,实验分为对照组（Control）、空白脂质体组、单纯超声组、二氢卟吩e6组（Ce6）、二氢卟吩e6声动力组（Ce6-SDT）、二氢卟吩e6磁性声敏纳米脂质体组（Ce6/SML）、二氢卟吩e6磁性声敏纳米脂质体声动力组（Ce6/SML-SDT）,采用MTT比色法,考察二氢卟吩e6及二氢卟吩e6磁性声敏纳米脂质体的肿瘤细胞毒性作用;检测对照组和各实验组细胞SOD、GSH-PX酶活性,确定超声对二氢卟吩e6的激活作用。4.A549肺癌移植瘤模型建立裸鼠右腋皮下注射A549肺癌细胞,每天观察接种部位有无感染,肿瘤生长后有无自然消退现象;记录肿瘤生长情况。5.二氢卟吩e6磁性声敏纳米脂质体对A549肺癌移植瘤杀伤作用采用小动物活体成像系统确定各实验组给药后的具体超声治疗时间;体内抗肿瘤实验分为模型组（Control）、二氢卟吩e6组（Ce6）、二氢卟吩e6声动力组（Ce6-SDT）、二氢卟吩e6磁性声敏纳米脂质体组（Ce6/SML）、二氢卟吩e6磁性声敏纳米脂质体声动力组（Ce6/SML-SDT）、二氢卟吩e6磁性声敏纳米脂质体磁靶向声动力组（Ce6/SML-MSDT）,各实验组按二氢卟吩e6计10 mg/kg尾静脉给药,模型组注射等体积生理盐水。隔天给药,每天测量瘤径和荷瘤裸鼠体重,共计16 d。给药结束,麻醉后摘眼球取血,取肿瘤组织制备HE染色切片。6.二氢卟吩e6磁性声敏纳米脂质体对A549肺癌移植瘤杀伤作用的初步机理研究模型组和各实验组检测血清中肿瘤因子TNF-α、肿瘤组织中CAT、SOD、GSH-PX酶活性和VEGF、ANG蛋白表达。检测二氢卟吩e6磁性声敏纳米脂质体（Ce6/SML）声动力靶向给药系统对相关酶活性和蛋白表达的影响。7.二氢卟吩e6微透析探针回收率的研究为了证明体内超声对脂质体中二氢卟吩e6的促释作用,拟建立二氢卟吩e6体内外微透析采样方法,检测各组裸鼠肿瘤组织内的二氢卟吩e6浓度。三、结果1.二氢卟吩e6分析方法的建立采用高效液相色谱法进行检测,色谱条件如下:Aglient1260色谱仪;色谱柱:Aglient HC-C18柱（4.6 mm×150 mm,5μm）;流动相:乙腈-磷酸二氢钾（60:40,磷酸调节p H至2.1）;流速:1 m L/min;检测波长:403 nm;柱温:室温;柱压:80 bar。在此色谱条件下,峰型对称,保留时间7.53 min,线性范围、检测限、定量限等都符合实验要求。2.二氢卟吩e6磁性声敏纳米脂质体的制备和质量评价制得二氢卟吩e6磁性声敏纳米脂质体（Ce6/SML）冻干粉为淡绿色均匀干燥粉末。平均包封率为93.80%,载药量为2.33%,粒径为166.40 nm;体外声敏特性良好。3.二氢卟吩e6磁性声敏纳米脂质体的细胞毒性试验和细胞酶活性试验单独超声组和空白脂质体组对肺癌A549细胞生长无抑制作用。药物浓度在200～1000μg/m L范围内,肿瘤细胞杀伤作用:Ce6-SDT>Ce6;Ce6/SML-SDT>Ce6/SML。提示一定频率和强度（1 MHz,2.5 W/cm2）的超声可以激活积聚在肿瘤细胞内的二氢卟吩e6,抑制肿瘤细胞生长。肿瘤细胞酶活性,与Control组相比,Ce6、Ce6-SDT、Ce6/SML、Ce6/SML-SDT组均有显著性差异（p<0.01）;分别与Ce6组和Ce6/SML组相比,Ce6-SDT组和Ce6/SML-SDT组酶活性显著下降（p<0.01）;提示超声可激活二氢卟吩e6,与细胞毒性实验结果一致。4.A549肺癌移植瘤模型建立本次实验成瘤率为100%;细胞成瘤迅速,肿瘤生长均匀。5.二氢卟吩e6磁性声敏纳米脂质体对A549肺癌移植瘤杀伤作用由小动物活体成像系统确定各需要超声治疗的组别,均在给药后1h进行超声。体内抗肿瘤活性:Ce6-SDT>Ce6;Ce6/SML-MSDT>Ce6/SML-SDT>Ce6/SML>Ce6;初步证实本实验所建立的二氢卟吩e6磁性声敏纳米脂质体（Ce6/SML）声动力靶向给药系统可行。尽管体外实验证明了二氢卟吩e6磁性声敏纳米脂质体的声敏特性,但本实验不能确定给药系统中超声对体内脂质体中二氢卟吩e6的促释作用。6.二氢卟吩e6磁性声敏纳米脂质体对A549肺癌移植瘤杀伤作用的初步机理研究酶活性（SOD、CAT、GSH-PX）实验:Control>Ce6>Ce6-SDT;Control>Ce6>Ce6/SML>Ce6/SML-SDT>Ce6/SML-MSDT。VEGF和ANG蛋白表达:Control>Ce6>Ce6-SDT;Control>Ce6>Ce6/SML>Ce6/SML-SDT>Ce6/SML-MSDT。进一步证明了本实验所建立的二氢卟吩e6磁性声敏纳米脂质体（Ce6/SML）声动力靶向给药系统可行。但仍未证明超声对体内脂质体中二氢卟吩e6的促释作用,拟采用二氢卟吩e6体内微透析采样方法,通过体内药代动力学研究解决此问题。7.二氢卟吩e6微透析探针回收率的研究本课题组前期实验已成功建立二氢卟吩e6体内外微透析采样方法,并采用高效液相色谱法进行样品分析。由于二氢卟吩e6亲脂特性,本次研究利用不同浓度的乙醇进行改性,但现有条件无法使二氢卟吩e6有效透过微透析膜。四、结论本实验确定了二氢卟吩e6磁性声敏纳米脂质体（Ce6/SML）声动力靶向给药系统三重效应:外加磁场对磁性脂质体的磁靶向作用;脂质体对二氢卟吩e6的缓释作用;超声对二氢卟吩e6的活性激活作用。但未确定超声促进体内脂质体中二氢卟吩e6释放作用。