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在骆驼科动物和鲨鱼的血清中存在一种特殊的天然的缺失轻链仅有重链的抗体,即重链抗体（HCAb）。用基因工程的方法可以克隆得到这种抗体的抗原特异性的单一片段VHH,其相对分子质量很小约为15k Da是传统抗体的十分之一,所以也被称为纳米抗体Nanobody（Nb）。纳米抗体以其分子量小,可穿透血脑屏障;原核或真核系统中高表达;特异性强,亲和力高;对人的免疫原性弱等优点得到广泛而深入的研究。恶性黑色素瘤是皮肤组织的恶性肿瘤之一,近年来其发病率增长很快。EDNRB是黑色素细胞膜表面的蛋白,其配体是Endothelin（EDN）,EDN信号系统对于黑素前体细胞的生存、增殖、分化和迁移有着重要的意义。研究表明:EDNRB可促进黑色素瘤转移,还能改变肿瘤与周围细胞的相互作用,促使黑色素瘤的生长。因此EDNRB被认为是促进黑色素瘤发展的潜在驱动因子和肿瘤侵袭性的重要标志物。本研究中应用基因工程的方法获得了EDNRB的特异性纳米抗体,并进行了初步的亲和性检测。试验目的:以获得靶向EDNRB纳米抗体为目标。试验方法:使用人黑色素瘤A375细胞作为抗原免疫羊驼,使羊驼产生特异性抗体;从羊驼的血清淋巴细胞中提取出总RNA,通过逆转录的方法得到c DNA,以此为模板,设计不同的引物进行两次PCR后可得到VHH片段;通过连接体系和电转化,得到特异的纳米抗体免疫文库;通过对文库菌的4轮筛选,获得了高亲和性的抗EDNRB的特异性纳米抗体。试验结果:本研究成功构建了库容大小为1.2×108个/ml的抗人黑色素瘤表面蛋白EDNRB纳米抗体的噬菌体展示文库。经鉴定:抗EDNRB纳米抗体库的插入率为80%,文库的丰度为1.47×1012个/ml。通过对文库菌的筛选得到了5个阳性较强的单克隆菌株,对阳性单克隆进行诱导表达后,通过ELISA、Western和免疫组化的检测,得到了结合活性最佳的一个单克隆抗体菌株Nb4。实验结论:通过噬菌体展示技术成功构建了抗人黑色素瘤表面蛋白EDNRB纳米抗体的噬菌体文库,筛选和表达后获得了具有较高抗原结合活性的抗EDNRB单克隆纳米抗体,或可用于人黑色素瘤的病理诊断和治疗。