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真菌蛋白激发子Hrip1是从极链格孢菌(Alternaria alternata)中分离得到的一种超敏反应诱导蛋白,分子量为17.6KD。Hrip1诱导烟草细胞坏死、介质碱化、钙离子流动和ROS积累等一系列防御反应,并且提高烟草对TMV的系统抗性。为了进一步研究Hrip1蛋白在水稻上的功能,明确Hrip1诱导水稻产生防御反应的机制。本研究在毕赤酵母细胞中表达蛋白激发子Hrip1,并研究Hrip1诱导水稻抗稻瘟病的作用;通过酵母双杂交技术筛选Hrip1在水稻中的互作蛋白,同时利用GST pull down进一步证明了二者的相互作用;为了研究互作蛋白的功能,利用CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术得到了互作蛋白基因敲除的水稻突变株。获得了以下研究成果:1、成功进行了Hrip1的真核细胞表达成功构建了毕赤酵母重组表达载体pPICZαA-Hrip1,转化毕赤酵母,通过Zeocin浓度梯度筛选获得了正确的酵母转化子。通过甲醇诱导表达和亲和层析纯化得到了纯化的重组蛋白。Western blot检测证明了表达该蛋白为Hrip1。重组蛋白Hr ip1具有天然Hr ip1蛋白的活性,可以引起草叶片过敏性坏死反应,最低作用浓度为10μM。2、Hrip1诱导水稻的抗病性反应用浓度为30μM的Hrip1处理水稻,48小时后喷雾接种稻瘟菌孢子悬浮液,结果表明Hrip1能够明显提高水稻对稻瘟菌的抗性,水稻细胞内源水杨酸含量升高,并在48小时达到最高值;防御反应相关酶PAL、POD、CAT活性也显著提高。这些结果表明,Hrip1可以诱导水稻的防御反应,可能通过水杨酸途径激活了水稻对稻瘟菌的抗性。3、筛选获得了Hrip1水稻互作蛋白为了探究Hrip1诱导水稻产生抗病性的机制,通过酵母双杂交实验,成功在水稻c DNA文库中筛选到一个Hrip1互作蛋白,命名为Hrip1-BP。Hrip1-BP在拟南芥中的同源蛋白为CSN5,是一个类泛素蛋白,在植物与病原物的互作中发挥重要作用。4、体外验证了Hrip1与水稻中互作蛋白的特异性根据水稻库中Hrip1-BP的序列信息,设计特异引物,得到了Hrip1-BP的全长表达序列。通过构建pGEX-6p-2-Hrip1-BP重组载体,转化大肠杆菌表达菌株BL21,成功得到了可溶性Hrip1-BP重组蛋白。用GST pull down技术验证了Hrip1-BP能够与Hrip1相互作用。5、获得了敲除互作蛋白基因水稻突变体为了进一步阐明Hrip1-BP在Hrip1诱导水稻免疫反应中的作用,采用CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术,对水稻中Hrip1-BP进行敲除。通过对目的基因的第一外显子区域的两处位点进行了定向编辑,最终得到了47株突变株,基因型包括双等位突变、纯合突变和杂合突变。