【摘 要】
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目的:通过全基因组Cas9筛选肝细胞癌对索拉非尼刺激相关的具有敲除后增敏作用的关键基因,并进一步利用Affymetrix全基因表达谱芯片分析索拉非尼靶向治疗耐药和敏感临床肝细胞癌样本,筛选得到差异表达基因,最后分析得到与索拉非尼靶向耐药作用密切相关的基因:耐药/敏感基因,为临床肝细胞癌病人应用索拉非尼靶向治疗提供分子预测指标。方法:1、文库扩增和慢病毒包装,前期预实验筛选条件的摸索:选择人SMMC
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目的:通过全基因组Cas9筛选肝细胞癌对索拉非尼刺激相关的具有敲除后增敏作用的关键基因,并进一步利用Affymetrix全基因表达谱芯片分析索拉非尼靶向治疗耐药和敏感临床肝细胞癌样本,筛选得到差异表达基因,最后分析得到与索拉非尼靶向耐药作用密切相关的基因:耐药/敏感基因,为临床肝细胞癌病人应用索拉非尼靶向治疗提供分子预测指标。方法:1、文库扩增和慢病毒包装,前期预实验筛选条件的摸索:选择人SMMC-7721肝癌细胞、支原体检测,行细胞倍增时间测试,Puromycin筛选预实验,行IC50实验及确定索拉非尼药物的最适浓度,文库病毒感染预实验确定最适MOI;2、Cas9-sg RNA文库药敏筛选模型的建立及高通量测序:扩增肝癌细胞系SMMC-7721并大规模感染,puromycin药筛后,加入索拉非尼合适药物浓度后培养细胞,分别在0天、7天、14天收细胞,提取细胞基因组DNA,纯化后,扩增sg RNA,后续行高通量测序分析sg RNA在3个时间点的变化,筛选与索拉非尼药物敏感相关的候选基因。3、临床样本筛选:应用affymetrix基因芯片对索拉非尼靶向耐药和敏感临床肝细胞癌样本进行表达谱分析,筛选得到肝癌肿瘤组织中差异表达基因。4、通过分析全基因组CRISPR/Cas9筛选得到对索拉非尼刺激相关的具有敲除后增敏作用的关键基因与临床样本基因表达谱芯片筛选的差异表达基因,最后初步得到与索拉非尼靶向耐药作用密切相关的基因:耐药/敏感基因。结果:1、在全基因组范围内共筛选出1723个药敏关键基因,其中加药后第7天分析（Day7 vs Day0）共发现339个具有敲除后增敏作用的关键基因;在加药第14天收集分析（Day14 vs Day0）共发现1438个上述基因。2、索拉非尼耐药和敏感临床肝细胞癌样本affymetrix基因芯片筛选得出1233个差异表达基因,其中上调基因数目为638个,下调基因数目为595个。3、通过全基因组Cas9筛选得到对索拉非尼刺激相关的具有敲除后（Knock-out）增敏作用的关键基因和利用索拉非尼耐药和敏感临床样本affymetrix基因芯片筛选差异表达基因两者交集;在肝癌细胞和组织水平,初步分析得到与耐药/敏感基因潜在相关的49个交集基因:其中包括CTNNB1（β-catenin）、MET（c-Met/HGFR）、HTATIP2等已被报道与索拉非尼耐药有关的基因,另有PRDX3、C10orf11、KCTD3、MAST4等候选基因可能与肝癌对索拉非尼药物靶向耐药潜在相关,其在肝癌中的表达及临床潜在价值,目前文献中未见研究报道,值得进一步深入探讨。结论:我们初步研究发现:CTNNB1（β-catenin）、MET（c-Met/HGFR）、HTATIP2、PRDX3、C10orf11、KCTD3、MAST4等候选基因可能与肝癌对索拉非尼靶向耐药/敏感密切相关,具有潜在的重要临床价值,其中β-catenin、c-Met、HTATIP2等已被报道与肝癌对索拉非尼靶向耐药相关;对该基因在肝癌对索拉非尼靶向耐药中的深入研究可为揭示肝细胞癌对索拉非尼耐药机制、提供有效靶向治疗分子预测指标等具有重要的临床意义。
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建议国家出台推进环卫产业发展的优惠政策,吸引更多社会资本进入"昨天聆听了李克强总理的报告,我感触很深,整篇报告都以人民为中心,是份顺民意暖人心的好报告,我完全赞同这份报告。城市环境与人民健康息息相关。作为‘城市美容师’的环卫工人,在疫情关键时期,有着不可推卸的责任与使命。做好垃圾分类,
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