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猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是目前危害养猪业最严重的传染病之一。该病的病原PRRSV属于尼多病毒目、动脉炎病毒科，为有囊膜的不分节段、单股、正链RNA病毒。GP5、GP3、M蛋白是PRRSV的主要保护性抗原，以GP5基因为免疫原研制的DNA疫苗能诱导一定程度的免疫应答，但注射免疫途径因实际操作和成本问题难以推广应用。 细胞内感染性细菌减毒后作为DNA疫苗载体是目前基因免疫研究的热点之一。鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)是一种较为常见的侵袭性胞内菌，通过基因工程方法减毒后对宿主致病性显著降低，但仍保留良好的侵袭力，可直接将真核表达质粒携带进入动物细胞内表达相应的蛋白而诱导特异性的免疫应答反应。但目前国内还未见减毒沙门氏菌作载体用于畜类DNA疫苗的报道。本研究探讨了利用沙门氏菌aroA基因突变株为载体传递PRRSV DNA疫苗的可行性。 本研究应用PCR技术，以构建好的PRRSV S1毒株GP5全基因重组质粒pcDNA3-GP5为模板，扩增了部分信号肽序列缺失的GP5基因(GP5’基因)，并将其克隆入pcDNA3.1的CMV启动子下游，构建成真核表达质粒pcDNA3-GP5’。序列测定结果表明克隆的GP5’基因全长525bp，编码175个氨基酸。序列分析和二级结构预测表明，GP5蛋白含有多个疏水区域，2～4个潜在的糖基化位点和一段疏水信号肽。核苷酸序列同源性比较发现，S1株与其它分离株的GP5’同源性在99％。利用脂质体转染试剂将重组质粒pcDNA3-GP5和pcDNA3-GP5’转染HEK-293A细胞，用RT-PCR技术证明目的基因mRNA的转录，同时用IFA方法证明目的蛋白能够在真核细胞中表达。 将真核表达质粒pEGFP、pcDNA3-GP5和pcDNA3-GP5’高压电转化至aroA突变的减毒鼠伤寒沙门氏菌SL7207株构建成3个重组沙门氏菌SL7207／pEGFP、SL7207／pcDNA3-GP5和SL7207／pcDNA3-GP5’。制备小鼠腹腔巨噬细胞，感染SL7207／pEGFP，经荧光显微镜可以检测到有荧光蛋白表达。将SL7207／pcDNA3-GP5和SL7207／pcDNA3-GP5’口服免疫小鼠，2d后提取肠道粘膜总RNA，可以检测到目的基因的转录和表达；同时制备免疫小鼠的腹腔巨噬细胞，用FITC标记的羊抗鼠IgG进行间接免疫荧光试验可以检测到特异性的黄绿色荧光。结果表明该减毒沙门氏菌不仅可将目的基因呈递给小鼠体细胞，而且，转运的目的基因可以获得转录和表达。以减毒沙门氏菌传递猪萦殖与呼吸综合征病毒DN人疫苗的口服免疫应答 本试脸比较了减毒沙门氏菌为载体传递PR]拐V DNA疚苗和裸质粒DNA疚苗的免疚效果以及GPS基因和GP5’基因的免疫效果.6至8周龄的雌性小鼠随机分成7组，每组16只.sL72o7lpeDNA3一GPS和sL7207lpeDNA3一GPS’以1。、fo的剂童口服免疫，裸质粒peDNA3一GPS和peDNA3一GPS，以10。陀皮内注射，共免疚4次，每次间隔巧天.结果表明，两种疫苗都诱导小鼠产生PRRSV中和杭体，最后一次免疫后14天口服组和注射组的中和杭体水平差异不显著.但SL72071 peDN六J一GPS和SL72071体DNA3心P5’免疫组至二免后14天才出现中和杭体.同时发现GPS基因免疫组的中和杭体水平要明显高于GP5’基因免疫组.口服免疫和裸质拉DNA免疚均诱导了小鼠IFN一丫的表达，而且对照组也表达了IFN一丫.结果表明，口服免疚可以诱导机体产生针对PRRSV的体液免疫应答，但是没有特异性的IFN一丫应答;PR]招VGPS蛋白中的信号肤序列和N末端的糖基化位点与PRRSV GPS蛋白的中和表位有关。 总之，本研究结果表明，以减毒沙门氏菌为载体传递PRRSV GPS基因的口服DNA疫苗能诱导小鼠产生杭PRRSV的体液和细胞免疚应答.口服DNA疚苗具有省时、方便、价康、易于群体免疚等优点，有望代替肌肉注射或基因枪等DNA疚苗的免疫方式，是研制低成本、实用化口服畜类DNA疫苗的一条新途径.如何提高P川妞VDNA疫苗的免疫效果、开发多价DNA疫苗、探明目的基因在体内的转录、表达和杭原递呈机理以及减毒沙门氏菌的生物安全性评估等方面还有待于进一步研究.