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疼痛对人类的健康危害甚大。脊髓背角既是接受传递外周伤害性信息的初级传入纤维终止的初级门户,又是起源于脑干的对伤害性信息的传入有抑制作用的下行抑制系统的终止部位,对伤害性信息的传递和调制发挥重要作用。以往的基础与临床研究均表明,在病理性痛刺激状态下,星形胶质细胞激活后产生并释放大量神经活性物质和前炎性细胞因子,作用于突触前终末,增强初级传入神经末梢伤害性神经递质的释放及痛信息的传递;作用于突触后的背角痛觉传递神经元,增强其敏感性和反应性,使神经元兴奋性增高。但对于在病理性疼痛产生和维持过程中,参与胶质细胞激活的分子及其机理尚不十分清楚。因此,阐明胶质细胞激活的机理对于解除疼痛折磨意义重大。以往在炎性痛和神经病理性痛模型动物上的研究表明,三磷酸腺苷（Adenosine triphosphate, ATP）和谷氨酸（Glutamate, Glu）分别通过受体机制参与伤害性信息的传递与中枢痛敏的形成。ATP通过7种离子通道型P2X受体和9种G-蛋白偶联P2Y受体产生作用。P2Y受体在初级感觉神经元的大、中、小细胞中均有表达,能够引起类似于伤害性反应的细胞兴奋,与痛觉感受有关。在星形胶质细胞表面主要分布有少量P2X受体和较多P2Y受体。但是脊髓背角星形胶质细胞是否表达P2Y1受体蛋白,并参与星形胶质细胞活性调节目前尚不清楚。本项目拟在以往本实验室对P2受体研究的基础上,在离体条件下,综合应用形态学、分子生物学及电生理学方法,观察P2Y1受体功能变化与脊髓背角星形胶质细胞活性变化之间的关系;以星形胶质细胞Glu释放为切入点,从不同角度探讨P2Y1受体对星形胶质细胞功能的调节作用以及其机理;胶质细胞P2Y1受体激活后释放的Glu对背角神经元细胞内钙离子浓度(the intracellular concentration of Ca2+,[Ca2+]i)以及全细胞膜电流的影响。方法:培养并纯化大鼠脊髓背角星形胶质细胞,免疫组织化学染色和免疫印迹技术观察P2Y1受体表达;激光共聚焦扫描显微镜（Confocal laser scanning microscopy,CLSM）观察ATP、ADP、ADPβS作用下背角星形胶质细胞[Ca2+]i变化;免疫组织化学染色和免疫印迹技术观察ATP、ADP、ADPβS作用后背角星形胶质细胞GFAP表达水平的变化;并观察P2Y1受体特异性拮抗剂MRS2179对ATP、ADP、ADPβS刺激背角星形胶质细胞[Ca2+]i和GFAP表达变化的影响。应用高效液相色谱（High Performance Liquid Chromatography,HPLC）观察ATP、ADP、ADPβS作用下背角星形胶质细胞Glu释放并分析机理;应用CLSM和全细胞膜片钳记录观察星形胶质细胞条件培养基（astrocyte-conditioned medium,ACM）作用下背角神经元[Ca2+]i浓度以及全细胞膜电流的变化。结果:第一部分:1.建立星形胶质细胞培养模型,免疫组织化学染色以及免疫印迹技术均表明体外培养的大鼠脊髓背角星形胶质细胞表达P2Y1受体蛋白;2.P2Y受体激动剂ATP、ADP、ADPβS （0.001-100μmol/L）剂量依赖性促进星形胶质细胞[Ca2+]i升高;100μmol/L的ATP、ADP和ADPβS显著增加[Ca2+]i,此作用可被特异性P2Y1受体拮抗剂MRS2179所阻断,并具量效关系;3.P2Y1受体介导了100μmol/L ATP、ADP和ADPβS促进星形胶质细胞GFAP表达增强的过程。这一结果提示,P2Y1受体介导星形胶质细胞激活。第二部分:1.P2Y受体激动剂ATP、ADP、ADPβS时间依赖性促进星形胶质细胞Glu释放;此作用可被特异性P2Y1受体拮抗剂MRS2179所阻断;2.ADPβS诱发的Glu释放可以被PLC抑制剂新霉素阻断,但不受细胞外钙浓度变化影响;ADPβS诱发的Glu释放可以被蛋白激酶C（protein kinase C,PKC）阻断剂白屈菜红碱（Chelerythrine chloride,Che）、容量敏感的Cl-通道阻断剂5-硝基-2-3苯酚丙胺苯甲酸盐[5-nitro-2 （3-phenyl propy lamino）–benzoate,NPPB],Na+-K+-2Cl-离子共同转运体阻断剂速尿部分阻断,但不被蛋白激酶A（protein kinase A,PKA）阻断剂H-89和缝隙连接半通道阻断剂辛醇阻断。第三部分:1.建立原代培养的背角神经元模型,在原代培养的背角神经元中添加ACM,神经元细胞内[Ca2+]i浓度升高;2.ACM刺激培养的背角神经元[Ca2+]i升高的效应可被N-甲基-D-天冬氨酸受体（ N-methyl-D-asparate receptor, NMDAR ）拮抗剂2-氨基-5-瞵酸基戊酸（2-amino-5-phosphonovaleric acid,AP-5）阻断,而不受P2受体非选择性拮抗剂苏拉明影响;3.ACM触发原代培养的背角神经元内向电流,此电流可以被细胞外直接给予Glu所模拟;4.ACM触发原代培养的背角神经元内向电流可以被NMDA受体拮抗剂AP-5和非NMDA受体拮抗剂CNQX所阻断,但以AP-5阻断为主。结论:1.在培养的脊髓背角星形胶质细胞表达P2Y1受体, P2Y1受体介导星形胶质细胞激活;2.ATP、ADP和ADPβS通过P2Y1受体途径诱发星形胶质细胞[Ca2+]i升高和Glu释放;3.ADPβS通过P2Y1受体途径诱发星形胶质细胞[Ca2+]i升高和Glu释放源于胞浆内IP3-敏感的内质网钙库释放Ca2+进入胞浆所致;4.ADPβS通过P2Y1受体途径诱发星形胶质细胞Glu释放受PKC,容量敏感的Cl-通道,Na+-K+-2Cl-离子共同转运体的调节,而与PKA和缝隙连接半通道无关;5.星形胶质细胞P2Y1受体激活释放的内源性Glu可以作用于原代培养的背角神经元上的NMDA受体和非NMDA受体,对神经元功能有调节作用;6.星形胶质细胞P2Y1受体激活释放的Glu对原代培养的背角神经元功能的调节作用可以被加入外源性Glu所模拟。综上所述,在培养的大多数大鼠脊髓背角星型胶质细胞表面分布有P2Y1受体, P2Y1受体介导星形胶质细胞激活并释放兴奋性递质Glu。星形胶质细胞释放的内源性Glu可以调节背角神经元NMDA受体和非NMDA受体功能。