肿瘤是严重威胁人类生命与健康的一类疾病。p53作为重要的抑癌基因,它是人类肿瘤中最常发生突变的基因之一,大约有半数肿瘤都有p53的突变。有趣的是,p53并不像其他大部分抑癌基因一样发生缺失或基因的截短,它的74%的突变都是点突变；在这些点突变中,97%发生在p53的DNA结合域。但是,研究发现,不同突变位点的p53突变蛋白在功能缺失和癌基因功能获得方面都有很大差异。因此,研究清楚不同p53突变蛋白的功能可以帮助我们更透彻地了解p53在肿瘤发生发展中的作用。在前期研究中,我们在几株ALT肿瘤细胞株中发现了同一个p53突变基因p53N236S(在人类中是p53N239S)的高表达,并且在体外实验中发现它以功能获得的形式具有癌基因潜能并与H-RasG12V协同促进肿瘤形成。根据IARC p53数据库,p53N239S的突变频率约为0.16%。虽然不是热点突变,但是它广泛存在于各类肿瘤中,在人类肿瘤的发生发展中发挥极其重要的作用。在国家自然基金的资助下,我们建立了p53N236S敲入小鼠模型。本文研究的一个方向就是探明p53N236S敲入小鼠中突变p53S在体内的功能缺失和功能获得。对p53S敲入小鼠的研究发现：p53S敲入小鼠中p53S突变蛋白不但丧失了调控细胞周期抑制和细胞凋亡的功能,而且还能促进肿瘤的转移,获得了新的癌基因功能。本研究从小鼠整体的存活情况,肿瘤生成情况和p53S敲入小鼠中p53S的功能两方面来展开。1)我们统计分析了p53S小鼠的生存曲线,肿瘤发生率,肿瘤谱和肿瘤转移率,并与p53敲除小鼠模型相比较。研究发现：①p53s/s小鼠与p53/-小鼠的生存曲线并无明显差异。同p53/小鼠一样,p53s/s小鼠在大约三个月左右就会罹患肿瘤,到十个月时,小鼠几乎全部死亡。在所解剖的40例p53s/s小鼠中,只有两例未发现明显的肿瘤。这提示我们,p53S已经丧失了调控细胞周期抑制和细胞凋亡的功能,不能抑制肿瘤的发生。另外,p53s/+小鼠的存活曲线与p53+/-小鼠的存活曲线也无明显差异。因为野生型p53的存在,大大延缓了小鼠的发病时间,延长了存活寿命。②通过对比p53S小鼠和p53敲除小鼠罹患的肿瘤类型,我们发现,p53S小鼠和p53敲除小鼠罹患的肿瘤都以淋巴瘤和肉瘤为主,并无明显差异。但是,与p53敲除小鼠不同的是,在p53s/+罹患的肉瘤中,我们发现约有40%的肿瘤存在转移,转移率明显高于p53+/-小鼠。并且在所检测的16例肿瘤中,只有两例发现有LOH。这提示我们,p53S可以在小鼠体内促进肿瘤的转移,获得了新的癌基因特性。有趣的是,之前研究者对p53热点突变R172H敲入小鼠分析发现：虽然R172H小鼠与p53敲除小鼠的存活曲线和肿瘤谱差异不大,但是R172H杂合小鼠的骨肉瘤等较易发生转移。这提示我们,虽然不是肿瘤突变热点,p53S小鼠与热点突变R172H小鼠的肿瘤生成情况有很强的相似性。鉴于以上结果,可能需要我们重新审视p53的非突变热点在肿瘤发生过程中的重要性。2)我们利用p53S小鼠和p53S MEF细胞研究分析了p53S的功能,结果发现：①在体内实验中,我们对p53s/s小鼠进行电离辐射,然后分析小鼠胸腺组织细胞凋亡和周期抑制相关蛋白的诱导表达情况。实时荧光定量PCR的结果显示：p53眺小鼠已经丧失了转录调控p21,PUMA等p53下游分子的能力。同时,在体外实验中,对p53s/s MEF细胞用阿霉素处理,然后分析细胞凋亡和周期抑制相关蛋白的诱导表达情况。Western blot的结果显示p53s/s MEF细胞也丧失了转录调控p21蛋白的能力,验证了体内实验的结果。这提示我们,p53S丧失了调控细胞周期抑制和细胞凋亡的能力。②在体内实验中,我们对p53s/+小鼠进行电离辐射,结果发现,p53s/+小鼠还具有调控p21,PUMA等p53下游分子的能力。同时,在体外实验中,对p53s/+MEF细胞用阿霉素处理,结果发现,p53s/+MEF细胞也还具有调控p21蛋白的能力。这提示我们,p53S杂合子中仍具有野生型p53的功能,在辐射或阿霉素导致的DNA损伤应激中,p53S并没有通过负显性抑制来影响其中野生型p53的功能。③我们对p53S MEF细胞和p53S小鼠肿瘤组织中的蛋白表达情况进行分析。结果显示：在p53s/+的MEF细胞中并未见p53蛋白的累积。但是p53蛋白在p53s/+小鼠的肿瘤组织中大量累积,与之前报道的李氏综合征病人的肿瘤组织中的情况是一样的。④我们通过划痕实验和transwell实验对p53S MEF细胞的迁移能力进行了分析。结果发现,与野生型的MEF细胞细胞相比,p53s/+和p53s/sMEF细胞的迁移能力增强。总结我们的实验结果,并结合之前对p53的研究结果发现：p53的突变与肿瘤的发生、发展和预后有着密切的关系。由于突变p53在肿瘤细胞中通常有较高表达,从而成为区别于正常细胞的一个特异性抗肿瘤靶点。在肿瘤细胞中重新激活野生型p53,使突变p53恢复野生型p53的功能；或通过无毒性天然药物靶向降解突变p53,降低突变p53促进肿瘤形成的作用,将是未来肿瘤治疗中的一个重要方向。针对突变p53的药物开发已经取得了一些成果,有一些药物已经进入了临床实验阶段。但是更多的天然植物资源等待我们去开发和研究,以期获得更多的疗效显著,毒副作用小的新药物。利用云南省特有的资源普洱茶,我们选择遗传背景清楚的,带有p53S的肿瘤细胞为筛选体系,并利用野生型MEF细胞来排除非特异的细胞毒性,研究普洱茶靶向调控突变p53S的抗肿瘤功效。对普洱茶抗肿瘤的研究发现：普洱茶可以通过下调突变p53S来抑制肿瘤细胞的生长。本研究主要得到以下发现：1)普洱茶在不影响野生型MEF细胞的浓度下,可以明显的抑制携带p53突变的肿瘤细胞系SCID22-3B-1, p53-/-+S+Ras的生长,对不携带p53突变的肿瘤细胞p53-/-+Ras的生长也有一定的抑制作用。2)为了进一步研究普洱茶对肿瘤细胞或野生型细胞生长的影响,我们通过流式细胞术分析了加茶前后野生型MEF细胞,p53-/-+Ras,p53-/-+S+Ras肿瘤细胞株的细胞周期。结果发现,p53-/-+Ras加普洱茶处理后,处于S期的细胞明显减少,处于G2期的细胞明显增多,发生了G2期阻滞。有意思的是,p53-/-+S+Ras加普洱茶处理后,处于S期的细胞明显减少,处于G1期的细胞明显增多,发生了G1期阻滞。但是同样浓度的普洱茶对野生型MEF细胞的细胞周期并无明显影响。3)为了研究普洱茶对肿瘤细胞生长抑制的分子机理,检测普洱茶是否靶向调控突变p53S。我们通过Western blot分析了加茶前后p53-/-+Ras,p53-/-+S+Ras细胞中p53等相关蛋白的表达情况。结果发现,p53-/-+S+Ras加茶处理后p53蛋白和HSP90蛋白的表达量降低,而p53-/-+Ras加茶处理后HSP90未见明显变化。这提示我们,普洱茶可能通过靶向调控突变p53S来抑制肿瘤细胞的生长。为了进一步验证这个结论,我们又通过Western blot检测了加茶前后p53s/s,p53s/s+Ras细胞中p53等蛋白的表达情况。结果发现,p53s/s,p53s/s+Ras细胞加茶处理后p53蛋白和HSP90蛋白的表达量均降低,验证了普洱茶靶向调控突变p53S这一观点。同时,我们也用Western blot和qRT-PCR检测了加茶前后野生型细胞中相应基因和蛋白表达。结果发现,普洱茶并未引起野生型细胞中p53的应激表达。有意思的是,普洱茶也降低了野生型细胞中HSP90的表达。4)那么,普洱茶是在转录水平还是在蛋白降解水平调控突变p53S的呢?为了解答这个问题,首先我们通过qR-T-PCR检测了加茶前后p53-/-+S+Ras细胞中p53mRNA的水平。结果发现,p53-/-+S+Ras细胞加茶后p53mRNA的水平降低。进一步,我们用蛋白酶体抑制剂MG132和普洱茶共同处理p53-/-+S+Ras细胞,通过Western blot检测处理前后细胞中p53蛋白的表达情况。结果发现,用MG132处理细胞可以部分抑制普洱茶对突变p53S的降低。这提示我们,普洱茶在转录水平和蛋白降解水平共同调控突变p53S的表达。5)普洱茶是一种成分复杂的复合物,我们期待分离纯化普洱茶抗肿瘤活性的有效部位或成分。首先我们通过四种方法初步分离出16种组分进行活性测定。通过组分对p53-/-+S+Ras细胞的作用分析,我们发现其中的茶组分B4,D1对细胞的杀伤效果与普洱茶相当。有趣的是,通过不同方法分离出来的B4和D1化学性质相似,表明我们的活性跟踪方法是可靠的。对活性部位的进一步的纯化分离和活性鉴定正在进行中。综上所述,在小鼠体内,p53N236S不但丧失了调控细胞周期抑制和细胞凋亡的功能,而且还能促进小鼠体内肿瘤的转移,获得了新的癌基因活性。而且普洱茶在不影响野生型细胞的前提下,通过靶向降低p53N236S来抑制肿瘤细胞的生长。对p53N236S敲入小鼠和普洱茶的研究不但为靶向调控突变p53的个性化治疗提供了理论依据,而且还为普洱茶作为低毒、高效、廉价的抗肿瘤剂的应用提供了线索。