猪链球菌二型(Streptococcus suis serotype 2)是一种重要的人兽共患病病原菌,对人或者动物均具有高致病率并导致高死亡率。脑膜炎是SS2感染导致的重要临床症状,但是SS2感染致脑膜炎特有的分子机制仍然有待研究。本研究主要探究EGFR在SS2菌株SC19致脑膜炎的过程中,介导神经炎症反应以及破坏细胞骨架的作用。主要结果如下:1.SS2菌株SC19介导严重的神经炎症反应SS2菌株SC19感染h BMEC,随着互作时间的延长,SC19黏附h BMEC的菌量显著上升。SC19感染CD1小鼠,发现出现脑膜增厚、出血,脑组织出现炎性细胞浸润以及噬神经元的病理变化。CD1小鼠在感染SC19后,多种细胞因子和趋化因子发生显著上调。同时,SC19感染h BMEC后炎性因子的转录也均有显著上调。2.SC19刺激h BMEC导致胞内蛋白酪氨酸磷酸化随后采用SC19感染h BMEC,检测细胞内蛋白分子的酪氨酸磷酸化,发现在180,100,和60k Da的位置均有蛋白发生明显的酪氨酸磷酸化。并证实180k Da大小的蛋白为EGFR。3.SC19感染介导配体依赖性的EGFR激活与二聚体化SC19感染h BMEC后,检测Erb B家族(EGFR/Erb B1、Erb B2、Erb B3和Erb B4)蛋白转录水平和翻译水平,发现EGFR、Erb B2和Erb B4的转录水平不变,而Erb B3的转录下调,翻译水平与转录水平结果一致。同时,通过免疫共沉淀和sh RNA技术分析发现,EGFR和Erb B3在SC19感染后发生酪氨酸磷酸化,并且介导EGFR和Erb B3形成异源二聚体。进一步比较活菌和热灭活的SC19感染h BMEC后EGFR的激活情况,发现活菌刺激激活EGFR,而在热灭活菌株刺激下EGFR不发生酪氨酸磷酸化。同时,SC19活菌感染能够上调EGFR的配体分子AREG、EREG和HB-EGF,而热灭活SC19刺激并不能上调上述配体的转录。并且,采用MMPs抑制剂抑制EGFR配体的剪切释放后发现,EGFR的激活随着抑制剂浓度的增高而减弱,表明SC19感染h BMEC介导配体依赖性EGFR的激活。4.体内体外实验表明抑制EGFR的激活不影响细菌的黏附与定殖为探究EGFR激活在SC19介导脑膜炎过程中的作用,我们随后采用EGFR的抑制剂AG1478进行预处理,并发现AG1478处理并不能减少SC19对h BMEC的黏附。同样,在SC19感染CD1小鼠时,比较AG1478给药组和不给药组的小鼠血液、脑组织和肺组织的细菌定殖量,并未发现表现出显著差别。5.EGFR的激活参与SC19感染导致的神经炎症反应随后,我们分析了AG1478处理对于SC19感染诱导神经炎症的影响。体外,我们发现AG1478处理能显著降低IL-6、IL-8、MCP-1、MIP-2以及GRO-α的转录。同样,体内在抑制EGFR的激活后,循环血液中炎性因子的表达没有明显改变,但在脑组织中细胞因子的表达量显著降低。6.EGFR通过MAPK-ERK1/2和NF-κB通路引起神经炎症反应使用NF-κB和MAPK-ERK1/2通路抑制剂处理h BMEC后发现,SC19感染诱导的IL-6和MCP-1转录显著被抑制。同时我们发现p65和ERK1/2在SC19感染后发生磷酸化,且感染前使用AG1478处理能显著降低p65和ERK1/2的磷酸化。此外,免疫荧光发现p65在h BMEC感染后明显入核,证实SC19感染后的确激活NF-κB通路,同时NF-κB通路的激活与MAPK-ERK1/2的激活无关。上述结果表明,SC19感染h BMEC介导EGFR激活后,通过MAPK-ERK1/2和NF-κB通路引起神经炎症反应。7.EGFR竞争结合ACTN4继而影响细胞骨架的稳定随后,通过免疫共沉淀实验发现,EGFR发生酪氨酸磷酸化的同时,其与ACTN4的结合有所增加。此外,ACTN4随感染也能发生酪氨酸磷酸化,并且在感染前,ACTN4主要与actin结合来维持细胞骨架的稳定;而在感染后,ACTN4被EGFR竞争结合,导致与actin的结合明显减少,继而影响了细胞骨架的稳定。综上所述,SS2菌株SC19感染h BMEC过程中,通过上调EGFR的相关配体分子AREG、EREG和HB-EGF,来介导EGFR的激活及EGFR/Erb B3异源二聚体的形成。EGFR的激活通过MAPK-ERK1/2和NF-κB通路引起h BMEC或脑组织中细胞因子和趋化因子的产生,导致神经炎症反应。此外,SC19刺激EGFR激活后还能竞争性的结合ACTN4,继而破坏由ACTN4维持的细胞骨架的稳定。