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第一章聚肌胞(PolyⅠ:C)对人脐血内皮祖细胞增殖的影响及其机制研究第一节人脐血内皮祖细胞表达Toll样受体的研究目的：分离纯化人脐静脉血来源的单个核细胞并诱导培养为内皮祖细胞,观察Toll样受体在人脐血内皮祖细胞中的表达情况。方法：采用密度梯度离心法分离人脐静脉血中的单个核细胞,用含多种生长因子的内皮祖细胞专用EBM-2培养基诱导培养,诱导单个核细胞向内皮祖细胞分化,通过形态学、免疫荧光及逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)检测并鉴定细胞的生物学特性；采用RT-PCR法检测静息状态下人内皮祖细胞(EPCs)表达的Toll样受体亚型；检测不同浓度的PolyⅠ:C对内皮祖细胞表达TLR3受体、炎性细胞因子的影响。结果：1.分离培养的内皮祖细胞早期以集落为中心呈放射状生长,晚期形成典型的“铺路石”样改变。荧光染色示DiL-acLDL和FITC-UEA-I双染色阳性；RT-PCR法检测示细胞表达干细胞表面标志物CD34、CD133、KDR,证明为内皮祖细胞。2.静息状态下,内皮祖细胞表达较高水平的TLR1、TLR3、TLR4、TLR6,表达较低水平的TLR2、TLR5、TLR7、TLR8、TLR10,不表达TLR9。而PolyⅠ:C能上调TLR3的mRNA及蛋白表达,并呈量效关系。3. PolyⅠ:C通过活化TLR3剂量依赖性上调炎性细胞因子IL-1p、IL-6、IL-8、TNF-α、IFN-p的基因表达。结论：EPCs表达功能性TLR3；PolyⅠ:C能呈剂量依赖性上调TLR3在EPCs的mRNA及蛋白表达,并通过活化TLR3剂量依赖性上调炎性细胞因子的mRNA表达。第二节PolyⅠ:C对人脐血内皮祖细胞增殖、凋亡的影响目的：观察TLR3的配体PolyⅠ:C对人脐血内皮祖细胞增殖、凋亡的影响。方法：采用不同浓度的PolyⅠ:C持续干预人脐血内皮祖细胞(EPCs),通过CCK-8细胞增殖试验检测其对EPCs增殖的影响及时间效应；通过流式细胞术检测不同浓度的PolyⅠ:C对EPCs细胞周期时相分布及细胞凋亡的影响。结果：1.与对照组相比,较高浓度PolyⅠ:C(1,10μg/m1)持续作用于脐血内皮祖细胞3天后显著抑制内皮祖细胞增殖；终浓度10μg/ml的PolyⅠ:C呈时间依赖性抑制内皮祖细胞增殖。2.较高浓度的PolyⅠ:C(1,10μg/m1)显著减少S期和G2/M期细胞比例,并通过下调细胞周期素A,B1,D1,E的表达阻滞细胞周期于G0/G1期而改变细胞周期的时相分布,从而抑制EPCs的增殖。3. PolyⅠ:C呈剂量依赖性诱导内皮祖细胞凋亡。结论：高浓度的PolyⅠ:C通过将细胞周期阻滞于G0/G1期并诱导细胞凋亡从而抑制EPCs增殖。第三节PolyⅠ:C诱导人脐血内皮祖细胞凋亡的机制研究目的：阐明PolyⅠ:C诱导人脐血内皮祖细胞凋亡的具体机制。方法：利用Caspase8的抑制剂和Caspase9的抑制剂抑制相应的信号分子,分析其对PolyⅠ:C诱导细胞凋亡的作用。以不同浓度的TNF-α及IL-1β干预EPCs24h后,CCK-8细胞增殖试验分别检测TNF-α和IL-1β对细胞凋亡的影响。利用IL-1β受体的中和抗体Anti-IL-1R1预先封闭IL-1β的结合位点,分析其对PolyⅠ:C诱导细胞凋亡的作用。结果：1. Caspase8和9的抑制剂并不能抑制PolyⅠ:C诱导的细胞凋亡。2.随着TNF-α作用浓度的增高,EPCs的细胞凋亡率并无明显增加。3.随着IL-1p作用浓度的增高,EPCs的细胞凋亡率逐步增加,并呈剂量依赖性。使用IL-1p受体的中和抗体Anti-IL-1R1预先封闭IL-1p的结合位点后,再加入PolyⅠ:C干预24h,结果显示高浓度的Anti-IL-1R1可以部分抑制PolyⅠ:C诱导的细胞凋亡。结论：PolyⅠ:C活化TLR3后通过上调IL-1p的表达诱导EPCs凋亡,而内、外源性细胞凋亡途径及TNF-a不参与PolyⅠ:C诱导的细胞凋亡第二章Pam3CSK4在人脐静脉内皮细胞中诱导非耐受性的细胞因子表达第一节Pam3CSK4对人脐静脉内皮细胞表达炎症因子的影响及其可能机制目的：阐明TLR1/2激动剂Pam3CSK4对人脐静脉内皮细胞表达炎症因子的影响及其可能机制。方法：以不同浓度的Pam3CSK4干预人脐静脉内皮细胞(HUVECs), RT-PCR法检测Pam3CSK4对TLR1、TLR2mRNA表达的影响。用RT-PCR法、Real-time RT-PCR法、ELISA法检测Pam3CSK4对HUVECs分泌TNF-α、IL-6的时间效应及剂量效应。分别用TLR1、TLR2及TLR1阻断剂阻断相应受体的表达,观察其对Pam3CSK4诱导HUVECs分泌TNF-α、IL-6的影响。用Western-blot法检测Pam3CSK4对MAPK家族及NF-κB信号转导通路的活化情况。结果：Pam3CSK4呈剂量依赖性上调TLR2的mRNA表达,而对TLR1mRNA表达的影响不明显。Pam3CSK4呈剂量依赖性上调TNF-α、IL-6的基因及蛋白表达量。加入TLR1、TLR2、TLR1/2受体阻断剂后均能明显抑制Pam3CSK4诱导的TNF-a、IL-6的基因表达上调,其中以TLR1/2受体阻断剂的阻断作用最明显。Pam3CSK4与TLR2结合后可以不同程度活化MAPK家族和NF-κB信号传导通路。结论：HUVECs表达功能性TLR2；Pam3CSK4与TLR2结合后活化MAPK家族和NF-κB信号传导通路,从而诱导炎症因子TNF-α、IL-6的分泌,且TNF-α、IL-6的分泌依赖于TLR1及TLR2的表达。第二节Pam3CSK4在人脐静脉内皮细胞中诱导非耐受性的IL-6表达目的：阐明预处理的TLR1/2激动剂Pam3CSK4重复刺激对人脐静脉内皮细胞表达炎症因子的影响及其可能机制。方法：以不同浓度的Pam3CSK4预处理人脐静脉内皮细胞(HUVECs)后,再用Pam3CSK4重复刺激HUVECs,用RT-PCR法、Real-time RT-PCR法、ELISA法检测Pam3CSK4对HUVECs分泌TNF-α、IL-6的影响。用不同TLR受体的配体预处理HUVECs后,再用Pam3CSK4重复刺激HUVECs,以观察不同TLR受体之间的耐受情况。Western-blot法检测Pam3CSK4重复刺激对MAPK家族及NF-κB信号传导通路的活化情况。RT-PCR法检测Pam3CSK4对负性调节蛋白锌指蛋白A20基因表达的影响,然后用质粒转染试验检测A20的过度表达对Pam3CSK4及LPS诱导的IL-6分泌的影响。用Notch信号通路抑制剂抑制相关分子,观察其对Pam3CSK4诱导HUVECs分泌IL-6的影响。结果：给予HUVECsPam3CSK4预处理后,再给予Pam3CSK4重复刺激可以下调TNF-a的基因及蛋白表达,而对IL-6表达无影响。LPS预处理可以使Pam3CSK4诱导的TNF-α表达下降,而对IL-6表达无影响。Pam3CSK4重复刺激HUVECs能抑制JNK通路的活化,而对p38、ERK、NF-κB信号通路的活化无影响。Pam3CSK4呈剂量依赖性上调负性调节蛋白锌指蛋白A20的基因表达,A20的过度表达对Pam3CSK4及LPS诱导的IL-6分泌无明显影。Notch信号通路抑制剂能部分抑制Pam3CSK4诱导的IL-6分泌。结论：1.Pam3CSK4重复刺激可诱导耐受性的TNF-α表达,而诱导非耐受性的IL-6表达。2.TLR2与TLR4之间存在交叉耐受性。3.Pam3CSK4可能通过Notch信号通路诱导非耐受性的IL-6表达。