【摘 要】
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猪圆环病毒3型（Porcine circovirus type 3,PCV3）是一种无囊膜结构的单股环状DNA病毒,于2016年被美国学者发现并报道。该病毒对猪的各个发育阶段都易感,尤其对仔猪有很强的感染力与致病力。自报道以来,它已在全球范围内出现。2017年,华中农业大学何启盖教授首次报到了国内PCV3感染病例及其临床症状,发现其和猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type
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猪圆环病毒3型（Porcine circovirus type 3,PCV3）是一种无囊膜结构的单股环状DNA病毒,于2016年被美国学者发现并报道。该病毒对猪的各个发育阶段都易感,尤其对仔猪有很强的感染力与致病力。自报道以来,它已在全球范围内出现。2017年,华中农业大学何启盖教授首次报到了国内PCV3感染病例及其临床症状,发现其和猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type 2,PCV2）极为相似,以猪皮炎肾病综合征（Porcine dermatitis and nephrotic syndrome,PDNS）为主要特征。目前市场上还没出现商品化的疫苗及诊断试剂盒,故建立一种快速准确的鉴别诊断方法对该病的防控至关重要。根据PCV2和PCV3的保守序列各设计了一对特异性引物,建立了检测PCV2和PCV3的双重PCR检测方法。通过优化反应条件和反应体系,确定最佳退火温度为56.0℃,最佳引物浓度为0.2μmol/L。本实验成功的建立了检测PCV2与PCV3的双重PCR方法,为猪圆环病毒的临床诊断提供了良好的方法,同时为诊断试剂盒的研发打下基础。利用PCR对PCV3的流行病学进行了调查研究,采集了2016～2018年期间中国不同地区（广东、广西、海南、江西、江苏、湖南、湖北、河南、山西、黑龙江）疑似PCV3发病的86个猪场猪的不同类型和阶段的1189份病料样品。检测结果显示:猪粪便、口鼻分泌物阳性率为46.19%（291/630）,血清阳性率为6.48%（16/247）,组织器官阳性率为27.24%（85/312）。通过采自3个PCV3阳性猪场不同阶段猪的粪便和口鼻分泌物检测结果显示:哺乳仔猪（1～20日龄）阳性率为59.17%（71/120）;保育猪（21～60日龄）阳性率为56.67%（51/90）;生长育肥猪阳性率为32.22%（29/90）;后备母猪阳性率为23.33%（21/90）;妊娠母猪阳性率为54.44%（49/90）;哺乳母猪阳性率为60%（54/90）;公猪阳性率为26.67%（16/60）。本研究中筛选并获得总共7株PCV3全基因序列,对其进行同源性分析发现:与韩国株和部分中国株之间的核苷酸相似性高达99.7%,但与PCV2基因的同源性差异较大。根据遗传进化树分析:与近几年发现和鉴定的PCV3中国株处于同一分支,其亲缘关系较接近。根据已测序的PCV3/GD/08/16毒株保守序列Cap基因设计一对特异性引物,同时在上下游引物分别加入Bam HI和HInd III酶切位点。通过测序成功的Cap基因连接到p MAL-c5x表达载体上,成功构建重组表达载体PCV3-Cap-p MAL并进行诱导表达,通过SDS-PAGE电泳确定重组融合蛋白的大小为约70 k D,主要以包涵体的形式存在。此外,用IPTG诱导浓度、温度和时间,确定最佳诱导浓度为0.5 m M,最佳诱导温度为37℃,最佳诱导时间为6 h。用上述确定的最佳诱导条件对重组蛋白进行Western blot印迹。结果表明,成功构建了PCV3-Cap-p MAL表达载体,为下一步ELISA方法的构建奠定了基础。
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