利用微生物进行金属硫化物氧化的过程,称之为生物浸出,是一种绿色环保冶金技术。嗜酸性喜温硫杆菌(Acidithiobacillus caldus,A.caldus)是一种专性化能自养的革兰氏阴性细菌,其生长pH值一般低于3,广泛分布于酸性热泉、硫化矿的酸性矿水之中,是生物浸矿的优势菌株之一。因A.caldus 具有高效的硫代谢能力和其重要的工业应用价值,受到人们的广泛关注。影响A.caldus 工业应用的不利因素是该菌生长周期长、生长得率较低,特别是在浸矿后期高铁、低pH的极端环境会对其生理活性产生强烈抑制,因此研究A.caldus 的环境适应性,具有重要的理论与现实价值。亚铁摄取调控蛋白Fur(Ferric uptake regulator)属于FUR蛋白家族,具有广泛的同系物。在不同细菌中对Fur蛋白进行的大量研究表明,该蛋白具有全局调控子的功能,其调控作用不仅与铁摄取和贮存相关,还具有包括氧化还原抗性、酸抗性、鞭毛运动与合成、呼吸作用等在内的大量“非铁”功能,能够调控与响应不同的压力刺激,在原核生物抗逆中发挥重要作用。在原核生物中feoB是feoABC操纵子中的主要功能蛋白,其表达主要受Fur蛋白调控,且受周围环境中铁离子含量的影响。在A.caldus中,Fur蛋白是否调控FeoB蛋白的表达,还能够调控哪些代谢通路,如何发挥调控作用等等,都未见报道。因此,深入系统地研究Fur的调控机制,对于完善A.caldus代谢调控网络,阐明其适应极端冶金环境的机制,具有很重要的意义。本论文首次对A.caldus中fur与feoB基因进行研究,主要开展了以下几个方面的工作:第一,将Fur与FeoB蛋白的氨基酸序列,与其它嗜酸硫杆菌属细菌进行比对,分析其进化关系,结果表明嗜酸硫杆菌属细菌Fur与FeoB蛋白亲缘关系较近,蛋白序列保守性较高,此外,根据Fur蛋白和FeoB氨基酸序列,利用在线软件分别对Fur蛋白的空间结构和FeoB的跨膜结构进行了预测,发现Fur蛋白结构与大肠杆菌相似,FeoB蛋白具有10个跨膜螺旋,与大部分细菌一致。第二,利用本实验室建立的无痕敲除系统,获得了亚铁摄取调控蛋白fur与亚铁转运蛋白feoB的敲除株,分别记为△fur和△feoB,同时构建了fur基因的回补菌株△fur(pJRD215-PtetH-fur)和过表达工程菌株 WT(pJRD215-PtetH-fur)。第三,通过测定菌株在不同起始pH值下的生长曲线及相应的菌液pH值变化,对野生型、△fur和△feoB突变株,以及回补、过表达菌株进行了生长特性分析。发现敲除株△fur和△feoB与野生型菌株相比在生长前期无明显差异,进入对数生长后期,其生长相对野生型菌株有明显降低;回补菌株△fur(pJRD215-PtetHHfur)与野生型生长情况基本一致,而过表达菌株WT(pJRD215-PtetHHfur)与野生型生长差异也主要出现在对数生长后期,且过表达菌株进入稳定期相对较晚,但最终生物量较高。因此,推测Fur蛋白主要在生长后期低pH值的条件下发挥作用。第四,通过荧光定量qPCR分析野生型、敲除株△fur和△feoB以及过表达菌株在以S0为能源时,相关基因的转录变化情况。研究发现,Fur蛋白的调控作用不仅包括铁摄取基因(包括亚铁摄取系统基因feoAB、mntH和三价铁摄取系统的相关基因)和铁贮存基因,还包括鞭毛相关结构基因、SOS响应调控蛋白、分子伴侣dsbG等相关抗逆功能基因。表明Fur蛋白不仅在铁摄取系统发挥调控作用,在该菌环境适应性中也发挥关键作用。此外,在△feoB中,铁摄取和贮存蛋白相关基因转录都发生了明显变化,Mn/Fe超氧化物歧化酶的表达也明显上调,表明铁离子在胞内氧化还原压力调控方面的作用十分关键。本项研究首次较为全面的分析了亚铁摄取调控蛋白Fur和FeoB蛋白的生物学功能,为进一步鉴定亚铁调控蛋白Fur的调控元,阐明其调控机制与调控网络提供了基础数据,具有较高的科学价值。