血小板源性生长因子（platelet-derived growth factor,PDGF）是多种类型细胞的分裂刺激素,在胚胎发育过程中,与多种器官间充质细胞、平滑肌细胞、血管周细胞以及肾脏的系膜细胞的发育密切相关,起到重要的调控作用。PDGF有四种亚型,包括PDGFA、PDGFB、PDGFC和PDGFD。具备生物活性的PDGF是由二条PDGF蛋白肽链组成的二聚体。一共可以形成五种具有活性PDGF配体,其中四种为同源二聚体,包括PDGF-AA、PDGF-BB、PDGF-CC和PDGF-DD;一种为异源二聚体PDGF-AB。PDGF通过激活二种酪氨酸激酶受体发挥作用,分别是血小板源性生长因子受体α和β（platelet-derived growth factor receptors,PDGFRαand PDGFRβ）。当PDGF配体结合到PDGFR时,可促使PDFGR二聚体化,从而激发受体激酶的活性。因此,PDGF信号可以通过三种类型的PDGFR二聚体传导,包括同源二聚体PDGFRαα和PDGFRββ和异源二聚体PDGFRαβ。有关PDGF信号通路在心脏发育中的功能及其调控机制所知甚少。本研究利用转基因和基因敲除小鼠模型,对Pdgfrα在小鼠心脏发育中的功能及调控机制进行了深入的研究,为进一步理解PDGF信号通路在心脏中的作用提供了重要的实验数据。首先,系统检测了Pdgfrα在各时期小鼠胚胎心脏中的表达。收集E10.5-E16.5各时期野生型小鼠胚胎,利用免疫荧光检测了Pdgfrα蛋白在各时期小鼠胚胎心脏中的表达模式。在E10.5-E11.5时,Pdgfrα在小鼠胚胎心脏的心室细胞中显著表达,在心房细胞中几乎不表达。在E12.5时,Pdgfrα的表达与E10.5-E11.5一致,只是其在心室细胞中的表达强度下调。到了E13.5时,Pdgfrα在小鼠胚胎心脏的心室细胞中也不再表达。到了E14.5-E16.5小鼠胚胎胚中,Pdgfrα在心脏的心室细胞中又开始出现表达,只是其整体表达强度较E10.5-12.5时期的低,同时其仍不在心房中表达。进一步利用Nkx2.5（工作心肌细胞的特异标记蛋白）抗体,检测其与Pdgfrα在心室中共表达情况,发现在E14.5-E16.5时期的胚胎心脏中,表达Pdgfrα的心室细胞不属于工作心肌细胞,而是心室中其他类型细胞（如成纤维细胞等）。此外,利用免疫荧光检测了Pdgfrα在E12.5-E16.5小鼠胚胎心脏窦房结中的表达模式。结果发现,从E12.5开始,Pdgfrα在窦房结中就有强烈的表达。随着小鼠胚胎不断发育,Pdgfrα在窦房结的表达量不断增强,一直到E15.5。但在E16.5小鼠胚胎心脏窦房结中,Pdgfrα的表达反而显著下调。Pdgfrα在早期（E10.5-E12.5）胚胎几乎所有的心室细胞（前体细胞）中表达,随后其表达转移到非工作心肌细胞中（主要为心肌间成纤维细胞等）。这预示着,Pdgfrα基因可能在调控心脏细胞的发育分化过程中发挥重要的作用。而且,可能与窦房结的形态发育有关。已有的报道表明,在PdgfrαEgfp/Egfp小鼠中,全敲除Pdgfrα可导致包括窦房结在内的静脉窦心肌细胞发育不全,并伴随Nkx2.5表达的上调。由于全敲除小鼠在E8.5后开始死亡,很难对其中的发育机制开展深入的研究。在本研究中,为解决早期胚胎死亡问题,我们利用Shox2-Cre和Pdgfrαflox/flox位点制备Pdgfrα在窦房结特异性敲除的小鼠模型,进一步开展研究。但我们惊奇的发现,与同窝对照小鼠比较,在Pdgfrα敲除小鼠中,未见窦房结的形态发育及心率和心电图异常。本研究又回头对E13.5PdgfrαEgfp/Egfp小鼠的窦房结进行了深入的检查,发现截止E13.5时,突变小鼠的窦房结形态也同窝野生型小鼠比较也未见任何异常,免疫荧光检测显示,Nkx2.5的表达水平也没有改变。我们认为,在小鼠窦房结的早期形态发生过程中,Pdgfrα不是必须的。我们的研究结果修正了前人有关对窦房结发育过程中Pdgfrα所起的作用的认识。在上一章的研究中,我们发现了PdgfrαEgfp/Egfp小鼠的心室壁的内层心肌发育异常,表现出人类心肌致密化不全的表型。由于PdgfrαEgfp/Egfp小鼠是全身性敲除了Pdgfrα,头部等器官发育异常,大部分胚胎约在E8.5死亡。虽然孕鼠在注射异丙肾上腺素后,可少量获得发育到E13.5的胚胎,但很难有效的进行Pdgfrα的敲除研究。因此我们进一步利用心肌细胞特异性的c Tn T-Cre小鼠与Pdgfrα条件性敲除小鼠(Pdgfrαflox/flox)交配,构建的c Tn T-Cre;Pdgfrαflox/flox小鼠可存活至出生左右。收获E13.5的c Tn T-Cre;Pdgfrαflox/flox胚胎进行细胞增殖、凋亡和下游分子机制等研究。我们首先精确分析了在野生型不同胚胎期小鼠心肌细胞的增殖情况,发现从E13.5开始,随着胚胎的发育,工作心肌细胞的增殖率呈现逐渐降低的趋势。其次我们对E13.5的c Tn T-Cre;Pdgfrαflox/flox小鼠心肌进行了细胞增殖测定,发现在心肌中Pdgfrα表达缺失明显导致了该时期心肌细胞增殖速率下调。随后我们还进行了细胞凋亡检测的发现,心肌中Pdgfrα表达缺失并不会导致细胞凋亡异常。我们进一步通过RNA-Seq对E13.5的c Tn T-Cre;Pdgfrαflox/flox和同窝对照的野生型小鼠的心室心肌进行了转录组差异基因分析,筛选出133个在敲除小鼠中呈现表达量明显上调的基因（log2Flodchange>2,p.value<0.05）和52个在敲除小鼠中呈现表达量明显下调的基因（log2Flodchange<-2,p.value<0.05）。进一步对这些基因进行了GO功能富集分析。发现上调和下调基因都在心肌组织发育,调节心脏生长等功能注释中大量富集。在这些差异基因中,Nkx2.5的表达随着Pdgfrα的敲除呈现明显的上调。利用免疫荧光,在E13.5的c Tn T-Cre;Pdgfrαflox/flox心肌中验证了这一结果,同时也通过荧光定量PCR验证了部分转录组筛选出来的差异基因在c Tn T-Cre;Pdgfrαflox/flox中的表达水平。综上所述,我们发现了在心肌中敲除Pdgfrα会导致细胞的增殖明显下调,并且导致心肌分化的关键基因Nkx2.5表达量明显上调,因此PDGF信号通路在心室心肌分化中有可能是通过Nkx2.5来发挥调控心肌增殖与发育分化。基因的缺失和过表达是遗传学小鼠研究中常见的研究方法。在第三章节的实验结果之上,我们进一步利用PDGFRα信号通路的条件性激活PdgfrαJ/+和PdgfrαK/+小鼠分别与c Tn T-Cre小鼠交配,在心脏中特异性激活Pdgfrα信号通路,并且进行表型分析和分子机制探究。其中PdgfrαJ/+小鼠是通过Pdgfrα的激酶区域位点的突变,实现PDGFRα信号通路的持续激活;PdgfrαK/+小鼠是通过突变Pdgfrα的活性抑制位点,实现PDGFRα信号通路的持续激活;K位点突变的活性增加量是J位点5倍。实验结果显示c Tn T-Cre;PdgfrαK/+和c Tn T-Cre;PdgfrαJ/+小鼠均能正常出生,而且成年。对这2种PDGFRα信号通路激活小鼠在成年和出生时的心电图检测发现,只有c Tn T-Cre;PdgfrαK/+小鼠的心电图呈现电轴右转,ST段下移的异常特征,而c Tn T-Cre;PdgfrαJ/+小鼠只呈现细微的异常。对P0的c Tn T-Cre;PdgfrαK/+和c Tn T-Cre;PdgfrαJ/+小鼠心脏进行了表型分析,结果显示c Tn T-Cre;Pdgfrα+/K小鼠的心脏呈现心室肥大的表型,但是c Tn T-Cre;PdgfrαJ/+小鼠与同窝野生型比较未见异常。其次,通过心脏切片的苯胺蓝染色,发现与同窝野生型小鼠相比,c Tn T-Cre;PdgfrαK/+小鼠胶原纤维含量在心室的内层心肌呈现明显增多,而c Tn T-Cre;PdgfrαK/+小鼠未见异常。进一步通过天狼猩红染色,发现c Tn T-Cre;PdgfrαK/+小鼠中III型胶原蛋白的比例大幅度提高,同时我们通过免疫荧光染色鉴定出c Tn T-Cre;PdgfrαK/+小鼠中Collagen蛋白表达同野生型相比明显提高,这些结果相互验证了心脏中PDGFRα信号通路的激活导致了心肌的纤维化程度提高。为力图解析发生这一表型的机制,检测了c Tn T-Cre;PdgfrαK/+小鼠心脏的增殖和凋亡情况。发现同野生型小鼠相比,c Tn T-Cre;PdgfrαK/+小鼠心脏的工作心肌细胞增殖速率增强,但凋亡未见变化。因此我们证明了PDGFRα信号通路的持续激活导致了小鼠心肌细胞增殖上调,进而导致了心肌纤维化细胞增多。进一步通过RNA-Seq对E13.5的c Tn T-Cre;PdgfrαK/+小鼠和对照小鼠的心肌组织进行差异表达基因分析,筛选出132个在c Tn T-Cre;PdgfrαK/+小鼠中呈现表达量明显上调的基因（log2Flodchange>2,p.value<0.05）和35个在c Tn T-Cre;PdgfrαK/+小鼠中呈现表达量明显下调的基因（log2Flodchange<-2,p.value<0.05）。对这些基因进行了GO功能富集分析,发现上调基因都大量富集在纤维化相关的功能注释中,而下调的基因的功能注释没有很显著的富集结果,但是下调基因集中我们发现了抑制心肌细胞增殖功能相关的基因,如Cdkn2a和Meis1的表达量随着PDGFRα信号通路的激活而下调,进一步证明了PDGFRα信号的激活将导致心脏细胞的增殖。而后,我们通过荧光定量PCR对与胶原合成表达以及细胞增殖相关基因进行了表达验证,证明了转录组数据的有效性。因此,在此章节的内容中,我们发现了在心肌中大幅度激活PDGFRα信号通路会导致心肌细胞的增殖速率上调,进而导致了心肌的纤维化程度提高,高强度的PDGFRα信号与激发心脏纤维化的发生和进展密切相关。