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研究背景:众多文献报道,慢性肾脏病(Chronic kidney diseases,CKD)患者CVD患病率和死亡率均较正常人显著增加,CKD患者血管易发生老化,但原因仍不清楚。血管老化是心血管疾病(Cardiovascular disease,CVD)发生发展的独立危险因素,其病理改变主要涉及内皮细胞和平滑肌细胞的衰老,因此,加强对血管老化的研究对 CVD 的防治具有重要意义。氧化物三甲胺(Trimethylamine-N-oxide,TMAO)是胆碱来源的肠道菌群代谢产物,主要经肾脏代谢,与心血管风险呈正相关。迄今为止,关于TMAO与血管老化及其相关机制的研究甚少。CKD患者由于肾脏功能受损,体内高TMAO水平是否影响血管老化引起了我们的关注。衰老的一个显著特征是衰老相关的分泌表型(Senescence-associated secretory phenotype,SASP)的表达。转录因子 GATA4作为衰老调节网络的关键开关,导致NF-κB活化和SASP的分泌。本课题通过观察TMAO对血管老化的作用,并探讨GATA4信号途径在其中的作用。研究目的:研究TMAO在细胞衰老和血管老化进程中的作用,并探讨TMAO是否通过促进GATA4的表达,进而激活转录因子NF-κB以启动SASP的分泌,发挥促炎促衰老的作用。研究方法:1.培养原代人脐静脉内皮细胞(Humanumbilicalveinendothelialcells,HUVECs)和人血管平滑肌细胞(Human vascular smooth muscle cells,HVSMCs),分别予50、100、200μM浓度的TMAO连续干预细胞3天,以构建衰老细胞模型。通过划痕实验和成管实验检测TMAO干预后内皮细胞的迁移和成环功能变化。采用5/6肾脏切除大鼠模拟慢性肾脏病(CKD),给予慢性肾脏病大鼠腹腔注射剂量为0.33μmol/100克体重/天的TMAO 3周。衰老相关标志物β-半乳糖苷酶(Snescence Associated β-Galactosidase,SA-β-gal)的活性、衰老相关基因P53、P21和P16的表达用于鉴定体内外细胞及血管老化的情况。2.采用qRT-PCR和Western-Blot检测细胞和血管中转录因子GATA4的mRNA和蛋白水平,Western-Blot检测NF-κB的蛋白水平,以及qRT-PCR检测 SASP 如 IL-1β、IL-6、IL-8、IL-18、TNF-α 的 mRNA 水平变化。3.采用干扰RNA沉默细胞中转录因子GATA4的表达,再予TMAO干预细胞 3天,通过衰老相关标志物β-半乳糖苷酶(Snescence Associatedβ-Galactosidase,SA-β-gal)的活性、衰老相关基因P53、P21和P16的表达来反应细胞衰老情况。并同时检测方法2中各基因的表达水平变化。通过划痕实验和成管实验检测细胞的迁移和成环功能变化。研究结果:1.TMAO可以促进内皮和平滑肌细胞衰老和血管老化(P<0.05),并可损害内皮细胞的功能(P<0.05)。TMAO可以增加细胞和血管中GATA4和NF-κB 的蛋白水平(P<0.01),可以促进 SASP 如:IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-8、IL-18 的分泌(P<0.05)。2.沉默转录因子GATA4的表达,可以明显抑制TMAO的促炎促衰老作用(P<0.01)。并改善TMAO诱导的内皮功能损伤(P<0.01)。研究结论:TMAO通过增加GATA4的蛋白水平,进而激活转录因子NF-κB以启动SASP的分泌,发挥促炎促衰老的作用。