一些细胞内的分子被发现是宿主抵抗病毒感染的第一道防线。胞嘧啶脱氨酶APOBEC家族的蛋白可以通过其脱氨酶活性导致病毒基因组DNA产生超突变或以一种未知的非编辑方式抑制病毒的复制。APOBEC3G（A3G）是该家族成员中第一个发现具有抗HIV-1功能的蛋白。目前发现A3G具有广谱的抗乙肝病毒（HBV），内源性转座子和逆转录病毒活性。APOBEC3F（A3F）也被发现具有类似的功能。它们可以被包裹进HIV-1病毒颗粒，在新感染细胞中使逆转录时合成的病毒cDNA上的脱氧胞嘧啶脱氨形成脱氧尿嘧啶从而导致病毒基因组上产生大量的G到A致死突变。除了该经典的抗病毒模式，它们还可以通过一种非编辑突变的形式起到限制病毒复制作用。然而HIV-1的vif蛋白能通过Cullin5-E3泛素化连接酶介导的蛋白酶体（proteasome）依赖途径使A3G和A3F降解。因此宿主A3G／A3F和病毒vif的相互作用可以影响到HIV-1的发病过程。在病毒产生细胞中A3G／A3F的量很大程度上决定了它们在新感染细胞中抗HIV-1的能力，故在体内诱导A3G／A3F表达被认为是一种有效的抗病毒策略。一、α干扰素调控抗病毒因子APOBEC3G不依赖经典STAT1信号通路但具有细胞类型依赖性干扰素常用于治疗病毒感染疾病。经典的IFN-α诱导转录途径是通过STAT1：STAT2异源二聚体同干扰素调节因子（IRF）-9形成复合体，该复合体再结合到IFN应答相关基因启动子的IFN刺激反应元件（ISRE）上。IFN-γ途径使用STAT1同源二聚体直接结合到启动子区的IFN-γ刺激反应元件上，并不需要IRF。本研究用qRT-PCR检测了IFNs在不同细胞中诱导A3G表达的情况。这些细胞有原代细胞（肝细胞，巨噬细胞和CD4⁺T细胞）和细胞株（肝癌细胞，H9细胞和293T细胞）。结果显示IFN-α在H9和293T细胞中不能诱导A3G表达，在原代肝细胞中IFN-α可以增加A3G表达24倍左右。在原代巨噬细胞IFN-α增加A3G表达为7倍左右。在肝癌细胞（HepG2，Hep3B，Huh7）中IFN-α刺激增加A3GmRNA量在6到10倍。这表明IFN-α诱导A3G具有细胞类型依赖性。IFN-γ在肝细胞中也能诱导A3G表达。为了研究A3G表达及IFN-α诱导A3G能力是否有个体差异，我们比较分析了四个供体（78，79，80和85）的对照原代肝细胞和IFN-α处理后这些细胞中A3G表达水平变化情况，结果发现在未处理细胞中A3G的表达水平有些波动（1到5倍），但是IFN处理后A3G表达水平变化在9到37倍。这表明IFN-α诱导A3G具有明显个体差异。PKC-δ的同源异构体被发现可以磷酸化STAT1上第727位丝氨基酸(Ser⁷²⁷)，这个修饰过程是ISG转录激活所必需的。用PKC-δ的特异抑制剂野桐霉素（Rottlerin，一种药物）处理Hep3B细胞，我们发现其阻断了IFN-α诱导A3G表达。但其它IFN-α诱导基因如PKR和ISG15则不受Rottlerin处理影响。PKC的总抑制剂在Hep3B细胞中不能抑制IFN-α诱导A3G的表达，这表明在肝细胞中PKC没有参与IFN-α的信号途径。在该细胞中STAT1的Ser⁷²⁷为组成性磷酸化，经IFN-α处理后该位点磷酸化能力加强。Rottlerin并没有减少IFN-α诱导该位点的磷酸化增强。Rottlerin还不影响IFN-α诱导的A3GmRNA的稳定性。这表明在肝细胞中STAT1没有参与IFN-α介导的信号途径，IFN-α诱导A3G的信号途径被Rottlerin敏感的分子特异的调控。我们还发现用特异siRNA下调STAT1并不抑制IFN-α诱导A3G。但STAT2的siRNA却能抑制IFN-α诱导A3G。Jak（Janus kinase）磷酸化701位的酪氨酸(Tyr⁷⁰¹)是STAT1二聚化和转录激活所必需的。Jak在Hep3B细胞中激活了STAT1，但STAT1它本身不在IFN-α诱导A3G表达中起作用。抑制Jak能有效的抑制IFN-α诱导A3G，这显示A3G转录激活需要Jak。因此，在Hep3B细胞中IFN-α诱导A3G表达是STAT1非依赖和STAT2依赖的。IFN-α刺激Hep3B细胞后IRF-9表达增强，但IRF-9的siRNA处理细胞部分抑制了IFN-α诱导A3G和其它ISG表达。因此在Hep3B细胞中IFN-α诱导A3G和其它ISG需要IRF-9。为了研究STAT1在IFN-γ诱导途径中是否起作用，用基因特异的siRNA转染Hep3B细胞下调STAT1和STAT2后，我们检测了A3G和其它ISG基因还能否被IFN-γ诱导。与预期一致，下调STAT1而不是STAT2有效的抑制了IFN-γ诱导A3G和对照基因IRE-1的表达。因此，在Hep3B细胞中STAT1对IFN-γ诱导基因转录途径是必需的。为了验证我们发现的STAT1非依赖的IFN-α诱导基因表达途径是否具有肝细胞特异性，我们检测了293T细胞中STAT1是否为IFN-α诱导基因转录所必需。用对照，STAT1或STAT2siRNA转染293T细胞，再用IFN-α或IFN-γ刺激。结果在该细胞系中A3G不能被IFN-α或IFN-γ诱导表达，而其它被IFN-α诱导的ISG如ISG15，MX1和LMP2的表达均可以被STAT1和STAT2siRNA特异的抑制。并且在293T细胞中IFN-γ诱导IRF-1和LMP2能被STAT1siRNA而不是STAT2siRNA特异的抑制。因此，与经典的IFN信号途径一致，STAT1在293T细胞中是IFN-α和IFN-γ诱导ISG必需的。二、干扰素调控抗病毒因子APOBEC3F表达具有细胞类型依赖性A3G和A3F可以共表达在许多组织和细胞中，如T细胞，巨噬细胞等。通过对A3G和A3F基因上游序列分析，发现它们具有很高的同源性。提示A3G和A3F基因表达可能受相似的转录因子和顺式作用元件所调控。用qRT-PCR检测IFN在原代肝细胞和多种肝细胞系中诱导A3F表达的情况。结果显示同A3G相似，干扰素α、γ能诱导A3F表达。在HepG2细胞中IFN-α诱导A3F表达4到12小时内达到高峰。8到24小时内IFN-γ诱导A3F表达达到高峰。在Hep3B细胞中IFN-α和IFN-γ也以一种剂量和时间相关的方式诱导A3F表达。我们还检测了几个健康供体的原代肝细胞中IFN诱导A3F表达的情况。结果表明IFN-α诱导A3G的表达水平在不同个体间有5到19倍的变化，IFN-α诱导A3F的表达不同个体间的差异在2到9倍左右。虽然在原代肝细胞中IFN-γ能有效的诱导IRF-1，但其在原代肝细胞中诱导A3F的能力比IFN-α低。我们还检测了IFN在原代CD4⁺T淋巴细胞中诱导A3F表达的情况。结果显示16小时内IFN-α和IFN-γ在一个供体的原代CD4⁺T淋巴细胞中都不能诱导A3F的表达。但在CD4⁺T淋巴细胞中其它ISG，如PKR和IRF-1分别可以被IFN-α和IFN-γ所诱导。这表明在原代CD4⁺T淋巴细胞中IFN介导的信号途径是有活性的。因此IFN诱导A3F转录调控可能与诱导PKR和IRF-1途径不同，其具有细胞类型依赖性。用qRT-PCR还检测到A3F在巨噬细胞中能被IFN-α有效诱导表达。在不同个体的原代巨噬细胞中IFN-α诱导A3F水平基本一致。IFN-γ诱导A3F表达的能力个体间存在较大差异。在一个个体的巨噬细胞中IFN-γ诱导A3F的能力同IFN-α基本一致，但在其它个体中IFN-γ基本上没有诱导A3F表达。三、抗病毒因子胞嘧啶脱氨酶APOBEC3G基因上游功能区域的鉴定从NCBI数据库可以发现A3G位于22号染色体的APOBEC3基因簇上。A3G的基因长度为10.61Kb，包括8个外显子和7个内含子。翻译起始位点位于第一个外显子。所有内含予以GT开始AG结束，符合典型的GT／AG规律。还发现Genbank中有多条A3GmRNA序列，它们有不同的转录起始位点。我们用5’RACE方法验证了A3G在一些细胞株和组织中是否存在多个转录起始位点。结果发现A3G在胎盘组织中可能有两个转录起始位点（-308和-40，ATG前一个碱基为-1）。在外周血细胞中同样鉴定出两个可能的起始位点（-280和-97）。对APOBEC3基因ATG上游5000 bp区域（-5000到-1，ATG之前的第一个碱基设为-1）进行比对分析发现，A3G和A3F基因上游具有较高的同源性，达78.33％。其它成员间的同源性均低于50％。A3G与A3F基因上游815bp（-815／-1）区域的同源性更是高达97.41％。这提示A3G和A3F基因表达受类似的顺式元件和反式作用因子所调控。这可能是A3G和A3F在一些组织和细胞中存在共表达现象的原因为了研究A3G基因调控区哪些位置控制着A3G的基因转录和对IFN-α起反应，我们构建了一系列包含有A3G转录调控区片段的荧光素酶表达载体，并分析了其在一些细胞中的启动子活性。结果表明其调控区的两个小片断（-397／-358和-82／-1）具有核心启动子功能。在不同细胞中评价所鉴定的A3G核心启动子是否对A3G基因转录起同样的作用，结果证实A3G基因上游区域（-397／-358和-82／-1）位置有启动子活性，而且在体外细胞系HepG2，QGY7701，293T和Hela细胞中这两个区域均有起始转录的功能。用Transfac4.0分析A3G启动子区域，在两个核心启动子区域均可发现转录调控因子Sp1的结合位点。转录因子Egr-1，RXR-alpha和Krox-20能结合-397／-358区域。在-82／-1区域则有ICSBP的结合位点。在干扰素刺激实验中我们发现A3G基因上游-358／-223位置没有IRSE功能。在HepG2细胞中A3G基因的上游区域-5785／-2643，-3403／-1和基因内-65／+1446区域也不对IFN-α刺激起反应。在Hep3B细胞中-1945／-1区域同样不对IFN-α刺激起反应。因此，在HepG2和Hep3B细胞中A3G的IFN-α刺激反应元件仍有待鉴定。在PMA刺激HepG2细胞的实验中发现PMA可以增强pGL2-A3G片断的荧光素酶活性2倍左右。推测PMA能增强A3G启动子的活性。本研究发现干扰素诱导A3G和A3F表达是细胞类型依赖的，并具有个体差异。还进一步发现肝细胞中A3G被IFN-α诱导表达是通过一种新的STAT1非依赖，STAT2依赖的IFN介导信号途径。对A3G转录调控区的研究发现，A3G有两个核心启动子和多个转录起始位点。它们可能在A3G基因表达和调控中起着重要作用。