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研究背景与目的 增生性玻璃体视网膜病变(proliferative vitreoretinopathy, PVR)是多种细胞及细胞因子参与的对眼内损伤过度修复反应，其形成是一个非常复杂的细胞网络结构过程，其中一种或多种细胞及细胞因子可能起着关键的调控作用。视网膜色素上皮细胞(retinal pigment epithelial cells,RPE)发生移位与增生是PVR发生的关键环节。表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)是一种具有酪氨酸蛋白激酶(protein tyrosine kinase,PTK)活性的膜表面受体，当与其配体结合后，可以介导细胞内有丝分裂信号，促进细胞的增生、移行、分化等。因此，观察EGFR在PVR中的作用，可能为其防治提供新的思路。本实验的目的是：①检测EGFR在PVR增生膜中的表达及与其病程的关系，并判断EGFR阳性细胞可能的来源；②观察表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)及血清对体外培养的人RPE细胞增生及移行的影响；③观察人RPE细胞增生中EGF-EGFR-MAPK信号转导途径的激活及其作用。 方法第.零医大学硕士学位论立 (l)对玻璃体手术中取出的PVR增生膜43例，按病程分为早期膜(<2个月)，中期膜(2一6个月)和晚期膜(>个月)，用免疫组织化学及原位杂交技术从蛋白质及mRNA水平检测EGFR的表达，并用免疫荧光双重标记技术判断EGFR阳性细胞来源。 (2)对培养的人3一6代RPE细胞采用MTT比色法观察不同浓度的EGF(0.In到111、In幼刀1、10n副111、SOnginl、10On幼nl)及血清对人 RPE细胞增生的影响;应用RPE细胞损伤模型，计数进入缺损区的细胞，定量观察EGF及血清对RPE细胞移行的影响。 (3)培养人的RPE细胞分别在0.1%小牛血清，10%小牛血清，10n副1llEGF+o.1%小牛血清及EGF+10%小牛血清作用下培养3天后，采用原位杂交及免疫细胞化学的方法，检测即E细胞上EGFRmRNA及蛋白质表达水平。使用抗磷酸化ERK摊抗体进行免疫细胞化学染色，以观察MAPK激活情况。 结果 (1)EGFR蛋白分子在早期膜中呈强阳性表达，中期膜中呈弱阳性表达，晚期膜中表达呈阴性。EGFR基因仅在早期膜中呈阳性表达。EGFR表达阳性的细胞同时可见细胞角蛋白 (eytokeratinpan)及巨噬细胞标记抗体(HAM一56)阳性表达，而神经胶质酸性蛋白(glial fibrillary aeidie protein，G队P)表达呈阴性。 (2)EGF呈浓度依赖性地刺激人RPE细胞的增生和移行。在刺激细胞增生的实验中:无血清组，10ng/ml一100n留ml EGF达到最佳刺激浓度，其增生率为81.8%;5%血清组，In留ml一10ng加lEGF的刺激作用最强达到1 22.7%;无血清组与5%血清组间有显著性差异(P<0.001)且5%血清可明显促进人RPE细胞的增生(P<0，001)。在细胞的移行实验中:无血清组，In留ml一100ng/ml EGF第.零医丈学硕士学位论立可促RPE细胞移行，但作用较弱;10%血清组中1呵ml一10ng/mlEGF促移行作用最强达438.9%;Ing/ml一10ong/ml EGr的促基础RPE细胞移行能力(最强为36%)低于10%血清诱导的RPE细胞的移行能力(强度为147%);无血清组与10%血清组间有显著性差异(P<0.001)。 (3) EGF刺激后，RPE细胞EGFR mRNA及蛋白质的表达增强。血清有协同EGF刺激的作用，而且血清增强其表达水平的程度强于EGF的单独作用;EGF作用后，磷酸化ERKI/2抗体由在细胞浆中表达转移至在细胞核中表达，即EGF对MAPK具有核转位作用。 结论EGFR主要存在于PVR的早期，可能介导的有丝分裂信号对PVR的发生发展起重要的调控作用。视网膜色素上皮细胞及巨噬细胞具有EGFR，在PVR早期的发展起重要作用。EGF对体外培养的人RPE细胞具有浓度依赖性促增生和移行的作用，最佳作用浓度为10ng八nl;血清自身也具有此作用并可加强EGF的这种作用。EGF可刺激人RPE细胞EGF一EGFR一MAPK信号转导途径，在人RPE细胞增生激活过程中起重要作用，因此阻断这一途径可能抑制RPE细胞增生，这为治疗PVR提供了一种途径。