七叶一枝花（Paris polyphylla var.Chinensis）是百合科重楼属植物,其根状茎为中药重楼的正品药源之一。七叶一枝花的根状茎具有多种活性成分,其中最重要的是重楼皂苷。当前,我国制药工业对重楼皂苷的市场供需缺口较大,这是因为包括七叶一枝花在内的多种野生重楼资源已濒临枯竭,且其人工繁育的周期长。为了缓解七叶一枝花的资源危机,满足制药工业对重楼皂苷的需求,利用合成生物学手段进行人工调控重楼皂苷的合成,已是当前的研究热点。然而,重楼皂苷的生物合成途径尚未完全解析。为了深入了解重楼皂苷的生物合成信息,本研究通过对七叶一枝花的多组织混合样本进行PacBio转录组测序分析,初步筛选出与重楼皂苷合成相关的候选基因并研究其表达特征,结合进化树分析,进一步筛选出2个可能与重楼皂苷合成相关的候选基因,在获得候选基因c DNA全长的基础上,对其进行了原核表达。本研究结果不仅为后期体外蛋白的催化验证等实验提供材料基础,同时也为解析重楼皂苷生物合成途径提供方向,本文取得的研究成果如下:（1）以七叶一枝花的根状茎、茎、叶、花、果荚及种子6个部位为样品,对其c DNA混合样本进行PacBio测序,获得52537个平均长度为2607 bp的高质量Isoform,将所得序列进行NR、Nt、KEGG、Swissprot和GO等数据库注释后,共注释得到了40725条Isoform,占所有鉴定到Isoform的77.52%;对所有高质量Isoform进行CDS预测,共得到39342个CDS,这些CDS的平均长度达到759 bp;此外,SSR分析表明,上述Isoform中的双核苷酸重复数最多,达到9925个。（2）根据全长转录组数据的KEGG分析结果,本研究筛选出12步重楼皂苷合成途径中的关键候选基因,随后分别提取七叶一枝花的根、根状茎、茎、叶、花和种子共6个组织的RNA样品,利用q RT-PCR技术,对筛选出的12步候选基因进行表达量分析。结果显示,12步候选基因中,有2个基因在所有组织中表达量均较低,3个基因主要在根状茎中表达,2个在花中表达量较高,3个在茎和叶中均高表达,另外2个在叶中高表达。（3）进一步利用生物信息学方法,对重楼皂苷合成下游途径中的糖基转移酶基因进行深入分析,从而筛选出45个尿苷二磷酸糖基转移酶（UGT）的候选基因,其中31个UGTs的C末端具有糖基转移酶特征盒子PSPG box。对上述45个UGT基因的蛋白产物进行理化性质分析和二级结构预测,结果表明45个UGT蛋白多为酸性蛋白质,长度在46～479个氨基酸之间。进化树分析显示,七叶一枝花中的45个UGTs基因主要分布在A、D、G、L、K组中,其中与皂苷合成相关的D组中有15个基因分布,UGT80亚组中有1个基因分布。表达量分析显示,45个UGTs中7个基因在根状茎中表达量显著上调,6个基因在叶中表达量显著上调,10个基因在茎中表达量显著上调,5个基因在种子中表达量显著上调,4个基因在花中表达量显著上调,13个基因在根中表达量显著上调。（4）利用电子克隆技术拼接出长度大于1000 bp且聚类于D组的2个UGTs基因的全长（PpUGT01和PpUGT42）。生物信息学分析表明,PpUGT01的c DNA全长为1485 bp,编码的蛋白长度为492 aa,编码产物的相对分子量为53836.69 Da,等电点为5.73,其不稳定指数和脂肪指数分别为34.22和90.22,该蛋白为亲水性蛋白,不存在跨膜结构域和信号肽。PpUGT42的c DNA全长为1446 bp,编码的蛋白的长度为482 aa,编码产物相对分子量为53241.54 Da,等电点为5.53,不稳定指数为47.38,脂肪指数为90.15,该蛋白为亲水性蛋白,不存在跨膜结构和信号肽。（5）分别构建PpUGT01和PpUGT42的原核表达载体,将其在大肠杆菌中进行原核表达分析。结果表明,PpUGT01在16℃下,以1 m M的IPTG进行诱导,16 h后,可以获得该蛋白的可溶性表达产物。PpUGT42在37℃下,以1 m M的IPTG进行诱导,4 h后,检测到了该蛋白的可溶性表达产物。综上,PpUGT01和PpUGT42在大肠杆菌中均可顺利表达,且表现为可溶性蛋白。（6）以薯蓣皂苷元和偏诺皂苷元为底物,尿苷二磷酸葡萄糖、尿苷二磷酸葡萄糖醛酸和尿苷二磷酸半乳糖为糖基供体,将PpUGT42的粗酶液在30℃条件下进行酶促反应12 h。反应产物用高效液相色谱检测,结果显示PpUGT42的粗酶液在该条件下未能催化薯蓣皂苷元及偏诺皂苷元发生糖基化反应。