【摘 要】
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背景绒毛外滋养细胞（Extravillous trophoblast,EVT）在母胎界面中起着至关重要的作用。尽管大量研究发现EVT发育异常和/或迁移和侵袭功能异常与子痫前期（Pre-eclampsia,PE）发生发展密切相关,但由于缺乏合适的体外细胞模型,因此其具体的发病机制仍不明确。环孢霉素A（Cyclosporin A,CsA）是一种强有力的大环内酯类免疫抑制剂,近年来许多研究发现CsA在母
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背景绒毛外滋养细胞（Extravillous trophoblast,EVT）在母胎界面中起着至关重要的作用。尽管大量研究发现EVT发育异常和/或迁移和侵袭功能异常与子痫前期（Pre-eclampsia,PE）发生发展密切相关,但由于缺乏合适的体外细胞模型,因此其具体的发病机制仍不明确。环孢霉素A（Cyclosporin A,CsA）是一种强有力的大环内酯类免疫抑制剂,近年来许多研究发现CsA在母胎界面中可诱导免疫耐来维持妊娠,并且低剂量的CsA可促进人类早孕期滋养细胞的增殖、侵袭及迁移能力。然而,CsA对人类早孕期EVT功能的影响及其调控机制并未明确。目的利用人胚胎干细胞（Human embryonic stem cell,hESC）和人绒毛来源的诱导多能干细胞（Human induced pluripotent stem cell,hiPSC）体外定向诱导分化为EVT;并在此细胞模型的基础上,初步探讨CsA对EVT细胞侵袭及迁移功能的影响。方法使用含Y27632、A83-01、NRG1、KSR及Matrigel培养基,对hESC/hiPSC进行为期9天的诱导分化过程。将诱导至第9天细胞进行KRT7（Cytokeratin7）抗体和HLA-G（Human leukocyte antigen-G）抗体孵育,利用流式细胞仪对其进行分析并收集KRT7和HLA-G双阳细胞。采用细胞免疫荧光和RT-q PCR技术对收集的KRT7和HLA-G双阳细胞进行EVT细胞相关标志物的检测。应用含浓度为0μmol/l、1μmol/l、10μmol/l CsA培养液对诱导的EVT（KRT7+/HLA-G+）细胞进行培养,观察其侵袭及迁移情况。结果1)hESC/hiPSC向EVT定向诱导分化的过程中,随着诱导时间延长,干细胞克隆样消失,上皮样滋养细胞及囊泡结构逐渐增加。D3集落样克隆生长减弱,并出现上皮样滋养细胞形态;D6见大量上皮样滋养细胞,且出现较多囊泡结构。2)流式细胞仪检测hESC/hiPSC向EVT（KRT7+/HLA-G+）诱导效率,发现hESC向EVT（KRT7+/HLA-G+）诱导效率低于hiPSC向EVT细胞（KRT7+/HLA-G+）诱导效率,但差异无统计学意义（P>0.05）。3)免疫荧光鉴定经流式细胞仪收集的KRT7和HLA-G双阳细胞,结果显示高表达滋养细胞标记物KRT7和EVT特异性标志物HLA-G及ITGA5,而干细胞多能性因子OCT4不表达;RT-q PCR鉴定结果与免疫荧光一致。4)CsA可促进hESC-EVT/i PSC-EVT侵袭及迁移能力,各CsA浓度间差异均有统计学意义（P<0.05）;且在1μmol/l CsA条件下其对侵袭和迁移能力的影响最显著。结论在体外利用含Y27632、A83-01、NRG1、KSR及Matrigel诱导体系,hESC/hiPSC可成功向EVT定向诱导分化;诱导获得的hESC-EVT/i PSC-EVT可能成为EVT功能调控或功能障碍相关疾病机制研究的体外细胞模型。同时在一定范围内（0μmol/l～10μmol/l）,CsA对hESC-EVT/i PSC-EVT细胞侵袭和迁移能力具有促进作用,可能为CsA在EVT功能障碍相关妊娠疾病的临床应用提供理论依据。
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