目的:研究加味芍药甘草汤通过介导miR-27a调控P53/EGFR/STAT3信号通路来治疗子宫腺肌病的干预机制,从分子水平上阐释加味芍药苷草汤治疗子宫腺肌病的深层机理,为进一步研究加味芍药苷草汤有效作用部位和临床优化处方提供实验基础。方法:1.选择自2015年9月至2016年5月在广州中医药大学第一附属医院住院并接受手术治疗的子宫腺肌病患者共10例,取其病灶组织进行细胞培养。2.以免疫化学法鉴定所培养的原代细胞;MTT法和流式细胞技术检测细胞的增殖情况、细胞周期分布和凋亡率;划痕实验以检测细胞的体外迁移能力;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测细胞中 p53-273H、LIF、EGFR、p-EGFR、c-Src、STAT3、p-STAT3、COX-2 的表达;RT-qPCR 技术检测细胞中 p53-273HmRNA、LIFRmRNA、miR-27a、EGFR mRNA的表达。结果:1.本研究共收集了 10例子宫腺肌病病灶组织,均培养成功。原代细胞培养24h后,其中的间质细胞基本贴壁,呈梭形排列;腺上皮细胞则呈漩祸状排列;平滑肌细胞呈长梭形或椭圆形,呈放射、平行排列。2.经免疫化学法(角蛋白、波形蛋白、平滑肌肌动蛋白)的鉴定,所培养的10例原代细胞为子宫腺肌细胞。3.各组细胞在相应药物处理24h、48h后增殖抑制率(IR%)的情况为:加味芍药甘草汤高、中、低浓度组对子宫腺肌病病灶细胞的IR与阳性组和空白组相比较具有显著差异(P<0.01),且加味芍药甘草汤高、中、低浓度组对子宫腺肌病病灶细胞的IR与用药时间呈正相关。4.各组药物作用24H、48H后,加味芍药甘草汤高、中、低浓度组细胞的凋亡率高于空白组,其中加味芍药甘草汤高浓度组分别与阳性组(P<0.05)和空白组(P<0.01)相比较,其差异具有统计学意义。同时,加味芍药甘草汤高、中、低浓度组处于G1/S期的细胞明显高于空白组,P<0.01其差异有统计学意义。5.各组药物作用于人子宫腺肌细胞24h后,加味芍药甘草汤高、中、低浓度组细胞的迁移受到抑制,并且三组细胞均存在不同程度的形态学改变,如细胞体积变小、细胞皱缩、细胞间隙变大等;阳性对照组、空白组和基质组的细胞向中间迁移。48h后,加味芍药甘草汤高、中、低浓度组的细胞划痕的距离进一步增大,而且这三组细胞的形态学变化更加明显,其中加味芍药甘草汤高浓度组出现部分漂浮的细胞;而阳性组的细胞则继续向中间迁移、生长,空白组和部分基质组的细胞则已完全愈合。用Image J软件测量24h和48h细胞迁移的距离,并计算所得划痕愈合率显示:加味芍药甘草汤高、中、低浓度组的细胞迁移率与空白组和阳性组细胞愈合率相比,具有统计学差异意义(P<0.05);加味芍药甘草汤对子宫腺肌病病灶细胞迁移力的抑制作用与中药浓度和用药时间呈正相关。6.加味芍药甘草汤高、中、低浓度组细胞中miR-27a基因的相对表达量较空白组高,24H和48H的加味芍药甘草汤高浓度组与对应空白组比较P<0.05,其差异有统计学意义;加味芍药甘草汤高、中、低浓度组细胞中p53-273H mRNA、LIFR mRNA、miR-27a、EGFR mRNA的相对表达量较空白组低,24H和48H的加味芍药甘草汤高浓度组与对应空白组比较P<0.05,其差异有统计学意义。用Spearman法检验miR-27a与p53-273H mRNA、LIFRmRNA、EGFRmRNA 的相关性,结果显示:miR-27a 与 p53-273HmRNA、LIFR mRNA和EGFR mRNA之间存在明显的负相关关系;p53-273H mRNA与LIFR mRNA、EGFR mRNA之间存在明显的正相关关系。7.将各组药物分别作用于人子宫腺肌细胞24h和48h后,加味芍药甘草汤高、中、低浓度组细胞的 p53-273H、LIF、c-Src、EGFR、p-EGFR、STAT3、p-STAT3、COX-2 蛋白表达较空白组均减弱。其中,24H加味芍药甘草汤高浓度组与24H空白组比较P<0.05,其差异有统计学意义;48H加味芍药甘草汤高浓度组分别与48H空白组、48H阳性组相比较P<0.05,其差异有统计学意义。结论:加味芍药甘草汤通过上调miR-27a,抑制了 EGFR mRNA和p53-273H mRNA的表达,从而降低了 P53/EGFR/STAT3 信号通路中 p53-273H、LIF、c-Src、EGFR、p-EGFR、STAT3、p-STAT3、COX-2等蛋白的含量,抑制了子宫腺肌细胞的增殖、促进其凋亡,并降低了细胞的迁移率。