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呈世界性分布的结核病可感染人类、多种哺乳动物和鸟类。牛结核病导致的牛奶产量、繁殖力下降以及体重、肉品的损失等每年对全球经济可产生30亿美元的影响,该病是OIE规定的必报传染病,我国的二类动物疫病;而人结核病目前仍然是单一致病因子中死亡率最高的传染病,所以结核病的存在不仅严重危害着畜牧业的健康发展,更威胁着人类的健康甚至生命。效果良好的疫苗对有效控制结核病尤为重要。BCG在预防结核病中发挥了重要作用,但在成人中的保护效果并不确定,而在研发新的结核疫苗中,几种快生长、非病原性的分枝杆菌,被作为结核疫苗的良好活载体,所以有必要研究其组分对动物机体免疫,尤其是BCG免疫效果的影响,为其进一步开发应用提供参考依据。首先为了筛选非结核分枝杆菌,复苏了母牛分枝杆菌、新金分枝杆菌和耻垢分枝杆菌,克隆到3种分枝杆菌的esx B基因以及耻垢分枝杆菌的esxA基因;分析表明,以上基因编码的蛋白均属于WXG100蛋白超家族成员;预测到4条肽链有线性B细胞表位和T细胞表位;其中耻垢分枝杆菌esxA、esxB基因编码的氨基酸序列与牛分枝杆菌相应氨基酸同源性分别为60.8和%72%;在母牛分枝杆菌、新金分枝杆菌的基因组中未发现esxA基因。然后构建了含有耻垢分枝杆菌esxA、esxB基因的重组原核表达质粒pET28a-sme-esxA、pET28a-sme-esxB,转化入E.coli BL21(DE3)中,发现二者可经诱导表达,Western blot分析显示,表达产物可以与耻垢分枝杆菌多克隆抗体发生反应。为了了解耻垢分枝杆菌的EsxA、EsxB对动物机体免疫的影响,实验又构建了重组真核表达质粒pVAX1-esxA、pVAX1-esxB和pVAX1-esxB-esxA,将三者转染至Marc-145细胞中,经间接免疫荧光技术和RT-PCR证实esxA、esxB可以在哺乳动物细胞中表达。在动物免疫实验中,用复苏的耻垢分枝杆菌噬菌体裂解耻垢分枝杆菌制备了细胞壁,与灭活的耻垢分枝杆菌、pVAX1-esxA、pVAX1-esxB、pVAX1-esxB-esxA及加有佐剂Quil A的免疫原分别免疫雌性BALB/c小鼠,再给部分实验动物接种BCG,分析耻垢分枝杆菌相应组分对BCG免疫的影响。免疫学检测结果表明,在细胞免疫方面,经PPD刺激后,灭活菌显著降低了BCG免疫的SI值;质粒组及灭活组小鼠血清中IFN-γ的浓度中均有与BCG差异不显著者,但细胞壁显著提高了BCG免疫小鼠脾淋巴细胞分泌IFN-γ的能力。在体液免疫方面,细胞壁组和联合质粒组中均有小鼠血清中IL-4的浓度高于BCG组者,PPD刺激的脾淋巴细胞分泌IL-4的能力在细胞壁组和联合质粒组中均有高于BCG组者,尤以细胞壁组最明显;细胞壁、灭活菌可以使BCG接种的小鼠血清中特异性抗体浓度增加,而质粒使BCG接种的小鼠抗体水平略有下降,但差异均不显著。流式细胞仪检测结果说明,质粒pVAX1-esxA、pVAX1-esxB-esxA和灭活菌更有利于BCG免疫的动物向细胞免疫方向发展。