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本研究利用第3代慢病毒载体系统构建携带大鼠Bcl-2基因融合增强型绿色荧光蛋白基因的慢病毒载体，包装成高滴度的病毒，在体外感染人卵巢原代颗粒细胞，检测加入化疗药物磷酰胺氮芥（环磷酰胺体外具有活性的代谢产物）后卵巢颗粒细胞的凋亡情况。进一步选择具有正常动情周期的大鼠，将携带Bcl-2基因的慢病毒经开腹的方式注射至双侧卵巢内，再给予环磷酰胺腹腔注射，观察重组慢病毒感染卵巢组织的情况及感染后卵巢结构和功能的变化，检测卵巢颗粒细胞的凋亡及凋亡相关蛋白Bcl-2的表达情况。研究B细胞淋巴瘤（Bcl）-2基因防护CTX损伤卵巢功能的可行性和有效性，为卵巢早衰的防治寻找一种新方法，解除卵巢早衰妇女的痛苦，提高生育能力及患病妇女的生活质量。
目的:
克隆大鼠Bcl-2基因并构建及鉴定大鼠Bcl-2基因慢病毒表达载体，包装纯化慢病毒颗粒，观察不同滴度慢病毒体外感染人卵巢原代颗粒细胞的表达情况及效率，探讨携带Bcl-2基因的慢病毒对化疗药物磷酰氨氮芥（PM）诱导的卵巢颗粒细胞凋亡的影响；将携带Bcl-2基因的慢病毒注入大鼠双侧卵巢内，再给予环磷酰胺（CTX）诱导卵巢损伤，探讨携带Bcl-2基因的慢病毒防护CTX损伤卵巢结构功能的作用。
方法:
1．利用RT-PCR方法，合成大鼠Bcl-2 cDNA序列，克隆至pMD18-T载体中，利用载体通用引物：M13F/R进行菌落PCR及测序；同时取PCR鉴定为阳性的克隆，用质粒提取试剂盒提取质粒，对含目的片段的阳性重组克隆进行全序列测定。两种测序结果均通过互联网用Advanced BLAST2．0软件与GenebBank中的大鼠Bcl-2cDNA序列进行同源性分析。
2．将测序正确的大鼠Bcl-2基因，经质粒提取、酶切连接到慢病毒载体表达质粒pGC-FU（含EGFP基因）中，构建慢病毒载体表达重组质粒pGC-FU-Bcl-2，通过酶切、测序进一步验证Bcl-2基因后，将重组质粒和包装质粒pHelper1．0，pHelp-er2．0三质粒共同转染人胚胎肾上皮细胞系293T细胞后包装出复制缺陷的高滴度慢病毒颗粒。以批量快速病毒滴定法检测慢病毒滴度。将获得的携带Bcl-2基因融合EGFP基因的重组慢病毒再次感染293T细胞，通过检测标志蛋白增强型绿色荧光蛋白（EGFP）和目的蛋白Bcl-2进一步验证重组慢病毒在细胞中的表达
3．从人卵泡液中分离培养卵巢原代颗粒细胞，并将不同滴度的重组慢病毒体外感染人卵巢原代颗粒细胞，观察重组慢病毒感染人卵巢原代颗粒细胞的效率及确定最佳感染复数，利用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）及蛋白质免疫印迹（Western blot）等不同方法检测Bcl-2基因的转录及其蛋白的表达情况。
4．在培养的人卵巢原代颗粒细胞中，加入不同浓度的化疗药物磷酰氨氮芥（浓度分别为15μmol/L、30μmol/L、45μmol/L），检测凋亡后选择最佳浓度进行实验。①实验组：在培养24h的卵巢颗粒细胞中加入MOI为100的pGC-FU-Bcl-2慢病毒，24h后再加入PM（最佳浓度）；②空载对照组：加入MOI为100的pGC-FU-EGFP慢病毒，再加入PM（最佳浓度）；③实验对照组：只加入最佳浓度PM；④空白对照组：不加PM及病毒。48h采用流式细胞仪、DNA-ladder检测凋亡、Hoechst33258染色检测卵巢颗粒细胞凋亡情况。采用Western blot检测卵巢颗粒细胞凋亡相关蛋白Bcl-2的变化。应用放射免疫法测定各组细胞培养上清液中E2的浓度。
5．将Wistar正常大鼠随机分为7组（n=16）：①对照组；②CTX组；③Bcl-2组；④EGFP组；⑤盐水+CTX组；⑥空载+CTX组；⑦实验组。
①组：不注射任何药物及液体。②组：仅腹腔注射环磷酰胺，具体方案如下：给予首次负荷剂量50 mg/kg后，以8 mg·kg·-1·d-1的剂量连续腹腔注射14 d；③组及④组：仅于双侧卵巢分别注射pGC-FU-Bcl-2及pGC-FU-EGFP慢病毒5μl。⑤组、⑥组及⑦组：分别于双侧卵巢注射生理盐水、pGC-FU-EGFP及pGC-FU-Bcl-2各5μl，24h后各组大鼠均以相同方案给予腹腔注射环磷酰胺，方案同前。
上述所有大鼠均观察动情周期、性激素、卵泡数目及卵巢结构。卵巢标本冰冻切片后，荧光显微镜下观察有无绿色荧光及其分布情况。采用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（TUNEL法）检测卵巢组织颗粒细胞的凋亡情况。采用蛋白质免疫印迹法（Western blot法）检测卵巢组织Bcl-2蛋白的表达。
结果;
1．从大鼠脾脏组织中提取的总RNA，琼脂糖凝胶电泳，可见3条清晰的RNA带（28S、18S与5S），反转录后获得cDNA，经PCR扩增后琼脂糖凝胶电泳，可见约720bpDNA条带。菌落PCR扩增后电泳，可见到873bp大小的阳性条带，选取阳性克隆进行测序。阳性克隆酶切后电泳得到720bp和2700bp区带，提取质粒进行测序。两种测序结果均进行同源性分析，同源性均为99%。
2．①重组质粒经酶切鉴定，测序结果显示pGC-FU-Bcl-2中插入片段序列与GeneBank中正常大鼠Bcl-2基因序列完全一致；②重组质粒中携有正确的Bcl-2基因，并能转染人胚肾上皮细胞；③pGC-FU-Bcl-2及包装质粒共转染包装细胞293T能产生重组病毒pGC-FU-Bcl-2，经纯化浓缩后慢病毒滴度高达5109IU/ml；④目的基因Bcl-2能被重组慢病毒高效地转导入人胚肾上皮细胞中，并能稳定表达，荧光显微镜下能直接观察到荧光蛋白，Western blot能检测到Bcl-2蛋白在靶细胞中的表达。
3．重组慢病毒感染人卵巢原代颗粒细胞后24h即可见到有绿色荧光蛋白表达，以后逐渐增强，72h可见到较强的EGFP表达，之后表达趋于稳定。病毒MOI小于100时，转染效率较低，病毒MOI为100时，转染效率较高，达60%，且细胞形态与生长方式与未感染细胞相同，细胞的正常增殖未受影响；MOI为200、400时，转染效率有所增高，但细胞病理现象明显，细胞变圆，漂浮，正常增殖受影响。用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）及免疫印迹法（Western blot）分别检测到被感染的卵巢颗粒细胞中Bcl-2 mRNA及分子量约为53KD蛋白质的表达，而阴性对照中无表达，表明重组慢病毒感染人卵巢原代颗粒细胞后，Bcl-2基因进行了有效的转录及蛋白的表达。
4．PM浓度为30μmol/L时，卵巢颗粒细胞的生长明显受抑制，凋亡率明显增高，DNA-ladder电泳表现为明显的梯带状，因此选用该浓度诱导颗粒细胞凋亡。流式细胞仪检测结果显示：实验组（GCs+PM+pGC-FU-Bcl-2）颗粒细胞凋亡率为6．99%±0．55%，比实验对照组（GCs+PM）及空载对照组（GCs+PM+pGC-FU-EGFP）明显低，但明显高于空白对照组（P<0．05）。实验组Bcl-2蛋白的表达明显增高，显著高于空载及实验对照组（P<0．05）。激素测定表明：实验组E2明显高于空载对照组及实验对照组，显著低于空白对照组。
5．①健康大鼠注射慢病毒后，大鼠动情周期及进食体重等生理活动无明显变化，注射环磷酰胺结束后2周，实验组曾出现短暂动情周期紊乱，停药后60天实验组87．5%大鼠动情周期恢复正常，其余3个化疗组（空载+CTX、盐水+CTX组及CTX组）大鼠均出现动情周期紊乱且未恢复；②停药后15天，实验组E2浓度已明显高于其余3个化疗组，FSH浓度则明显降低。随着时间延长，其余3个化疗组E2浓度进一步降低，FSH浓度进一步升高，而实验组则维持稳定，但与对照组相比，E2浓度仍明显降低，FSH明显升高。
结论:
1．本实验成功克隆了大鼠Bcl-2基因，为进一步研究Bcl-2 cDNA的基因功能及进行基因治疗奠定了基础。应用单菌落PCR及质粒酶切均可以成功鉴定出重组阳性克隆，两种方法测序结果吻合率达100%。单菌落PCR更加快速、简便、经济，避免了质粒抽提纯化的繁索及耗时，可以替代常规方法。
2．成功构建了携带大鼠Bcl-2基因融合绿色荧光蛋白基因的重组慢病毒载体，包装出高滴度、高纯度的慢病毒，转染人胚肾上皮细胞后能够稳定表达Bcl-2基因，为进一步研究该基因的功能和细胞凋亡相关疾病的治疗奠定了基础。
3．Bcl-2基因能够被重组慢病毒载体转入人卵巢原代颗粒细胞，并且持续表达，在MOI值为100时感染效率达60%，细胞具有最佳的生长状态。大鼠Bcl-2基因有效的进行了转录和蛋白表达，证实了病毒功能的完整性，也完成了Bcl-2从基因到蛋白水平的功能转化。
4．诱导颗粒细胞凋亡的最佳PM浓度为30μmol/L。慢病毒介导Bcl-2基因使颗粒细胞在体外能大量分泌抗凋亡蛋白Bcl-2，抑制卵巢颗粒细胞凋亡的发生，促进颗粒细胞在体外分泌E2，因此，对体外化疗药物磷酰氨氮芥诱导的卵巢颗粒细胞的凋亡有保护作用，可以改善颗粒细胞在体外分泌雌二醇的功能。
5．慢病毒在动物体内成功感染卵巢颗粒细胞，感染效率高，长期表达，副反应小，主要定位在卵巢间质及卵泡壁，可以作为体内实验基因治疗的良好载体。携带Bcl-2基因的慢病毒感染靶细胞后可以过度分泌Bcl-2蛋白，通过抑制卵巢颗粒细胞的凋亡，可防护环磷酰胺对卵巢组织结构的损伤，部分改善卵巢功能。