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肿瘤血管在实体瘤的发生发展中具有重要的作用，为肿瘤细胞提供氧气，养料并输送废物，同时提供转移的主要路线。蛋白酪氨酸激酶(Protein TyrosineKinase，PTK)在细胞分化，生长和代谢过程中起着重要作用。酪氨酸激酶的异常调控与许多肿瘤的侵袭和不良预后有着密切关系，是恶性肿瘤的重要特征。因此，靶向肿瘤血管以及酪氨酸激酶的新药研发已成为抗肿瘤药物研究的两个热点领域。
本论文分为两部分内容，第一部分工作中本文作者和美国俄亥俄州立大学合作，系统评价了C9的抗新生血管生成作用和抗血管作用，并对其作用机制进行深入研究。第二部分工作中本文作者建立了基于ELISA方法的FGFR1，FGFR2酪氨酸激酶抑制剂筛选模型，进行特异性以及非特异性FGFR1，FGFR2酪氨酸激酶抑制剂的筛选工作；同时建立了以Src为筛选用酶，基于荧光偏振技术的高通量筛选模型。
一、C9是美国俄亥俄州立大学Pui-Kai Li教授课题组在Combretastatin A4的结构基础上结合SU5416的结构特点合成的一个新结构化合物。本文作者对其进行了体外，半体内以及体内模型的系统检测，确定C9具有明显的抗新生血管和抗血管双重作用。首先采用人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelialcells，HUVECs)增殖、迁移、管腔形成模型检测C9对新生血管生成过程中几个主要步骤的作用，并对C9诱导内皮细胞凋亡的能力进行研究。结果表明，C9能够剂量依赖性地抑制HUVEC内皮细胞增殖，72h的IC50约为1μM；在对内皮细胞无增殖抑制作用的浓度下，C9对内皮细胞的迁移和管腔形成均具有很强的抑制作用，并呈现明显的量效关系。在浓度为0.5μM时明显抑制大鼠动脉环模型中的微血管形成：在CAM模型中5nmol/egg的剂量下即显示明显抑制血管生成作用。最后本文作者还检测了C9对不同组织来源肿瘤细胞株的生长抑制作用，结果表明C9对内皮细胞和肿瘤细胞具有较强的抑制作用，而对正常细胞的抑制作用较弱。
在对其抗新生血管生成作用分子机制的研究中，利用流式细胞术和TUNEL法检测，结果显示C9能够逆转VEGF和bFGF抗无血清诱导的内皮细胞凋亡；Westen blot法检测显示它可以剂量依赖性地下调生长因子VEGF和bFGF下游与新生血管生成相关的两条通路Raf-Mek-Erk和PI3K-AKT中Raf，Mek，Erk，Akt磷酸化，但是对VEGF受体KDR及bFGF受体FGFR1的磷酸化没有影响；同时，C9能够剂量依赖性地直接抑制内皮细胞中Raf、Mek、Erk的磷酸化，在高浓度时抑制Akt的磷酸化，表明C9主要通过抑制Raf-Mek-Erk通路而具有抑制新生血管生成作用。利用免疫荧光检测显示C9抑制新生血管生成的同时也明显破坏微管骨架结构，表明其微管解聚作用也是其抗新生血管生成作用的机制之一。
另外，C9不仅能够抑制新生血管生成，也具有抗血管的作用。体外既成管腔破坏实验表明C9在0.5-2μM条件下，呈浓度依赖性地抑制已形成的管腔，其中1μM，2μM的抑制作用较强；利用Matrigel plug模型检测C9抑制体内既成血管的作用，C9200mg/kg作用1小时后可以引起bFGF诱导的继成血管的破坏，血管灌注减少。内皮细胞形态的改变在化合物的血管破坏作用中具有重要意义，内皮细胞经C9处理30min，细胞收缩，细胞间隙增大，出现膜发泡的现象；免疫荧光实验显示，C9能够破坏微管骨架，改变微丝重构，这一点和体外抑制微管聚合以及微丝聚合实验一致。用ROCK抑制剂Y-27632和微管稳定剂Taxol预先处理，可以阻断C9对内皮细胞形态和新生成管腔的破坏作用；并且短时间处理内皮细胞可引起MLC磷酸化增强；表明C9通过破坏内皮细胞微管骨架，改变内皮细胞形态；引起磷酸化MLC上调导致其体外管腔破坏以及体内的血管破坏作用。
最后用多种方法检测C9和Tubulin蛋白的相互作用。体外无细胞体系实验显示C9能够抑制微管蛋白聚合，其IC50约为40μM，表面等离子共振(SPR)技术和远紫外CD光谱实验显示C9能够和Tubulin蛋白结合并影响微管蛋白的二级结构，运用荧光分光光度法确证C9与微管蛋白结合的位点和经典的Colchicine结合位点一致。
二、本文作者用昆虫杆状病毒表达系统表达了具有激酶活性的FGFR1，FGFR2受体酪氨酸激酶胞内催化活性区蛋白，鉴定并测定酶活性。基于酶联免疫吸附法(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA)的原理，建立了FGFR1，FGFR2受体酪氨酸激酶抑制剂的分子筛选模型。应用建立的FGFR1，FGFR2受体酪氨酸激酶抑制剂分子水平的筛选模型，对不同来源的数十个化合物进行筛选，发现了一些具有较强FGFR1，FGFR2酪氨酸激酶抑制活性的化合物。另外，本文作者利用Src酶建立了基于荧光偏振技术(Fluorescence Polarization，FP)的酪氨酸激酶抑制剂高通量筛选体系，利用市售的化合物验证了此体系的可行性，随后利用此高通量筛选体系对近700个化合物进行了筛选，得到数个有开发价值的先导化合物，结构改造正在进行中。