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目的：E1A激活基因阻遏子（cellular repressor of E1A-stimulated genes,CREG）是1998年Gill博士利用酵母双杂交技术克隆的一个转录调控相关因子。CREG基因可与外源性腺病毒蛋白E1A及哺乳动物体内转录因子E2F家族蛋白竞争性地结合在靶基因的启动子区，从而阻遏E1A蛋白和E2F对靶基因的转录，而E1A、E2F均具有促进细胞增殖的作用，所以CREG可能通过与E1A、E2F竞争性抑制作用而起到促进细胞分化、抑制细胞增殖的作用。本实验室前期研究发现，去血清能够诱导体外培养的人血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)从合成表型逆转为分化表型，同时CREG蛋白表达明显增加。大鼠颈动脉拉伤实验证实，CREG基因表达与VSMCs增殖能力呈负相关，推测其可能参与了VSMCs表型调控。Veal博士等证实CREG是一种分泌型糖蛋白，可以与胰岛素样生长因子II竞争性结合细胞膜胰岛素样生长因子受体II，以自分泌和旁分泌两种途径对细胞功能进行调控。为进一步明确CREG糖蛋白的功能,本研究采用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）、蛋白印迹（Westernblot）及Ni-NTA亲和层析等方法表达、纯化重组hCREG糖蛋白，并用流式细胞周期分析、5-溴脱氧尿嘧啶（BrdU）掺入实验等方法验证重组人CREG（hCREG）糖蛋白具备抑制体外培养的人胸廓内动脉平滑肌细胞(Human internal thoracic artery-Shenyang,HITASY)增殖的生物学功能，为hCREG蛋白的工程化生产提供前期研究基础。 方法：1、用RT-PCR技术扩增终止密码突变的hCREG开放读码框并构建pcDNA3.1myc-His/hCREG真核表达载体。2、Lipofectamine2000转染人293F细胞株并筛选稳定表达细胞克隆，Westernblot方法鉴定hCREG/myc-His融合蛋白的表达，糖苷酶法及Westernblotting行hCREG/myc-His融合蛋白的糖基化分析。3、根据6×His亲和层析原理，应用Ni-NTA柱纯化重组hCREG蛋白，纯化后蛋白通过HiTrap脱盐柱脱盐。4、用流式细胞周期分析研究添加0.5μg/mL、1μg/mL及2μg/mL重组hCREG/myc-His融合糖蛋白对体外培养HITASY细胞增殖的影响。用BrdU掺入方法研究添加重组蛋白对体外培养HITASY细胞增殖的影响。 结果：RT-PCR扩增含终止密码突变的hCREGcDNA片段，经BamHI和EcoRI双酶切构建了pcDNA3.1myc-His/hCREG真核表达载体，酶切及测序结果均证实构建的重组质粒正确。 稳定表达pcDNA3.1myc-His/hCREG的293F细胞及未转染的对照细胞裂解产物，分别以Anti-hCREG、Anti-myc及Anti-His行Westernblot检测。hCREG抗体可检测到转染组较对照组多两条约30KD的融合蛋白表达条带，myc抗体及His抗体均检测到大小约为30KD的融合蛋白表达。将稳定表达pcDNA3.1myc-His/hCREG的293F细胞裂解产物及经PNGaseF处理过的样品分别行Anti-hCREG、Anti-myc及Anti-His的Westernblot检测。结果显示经PNGaseF处理后，hCREG融合蛋白分子量由30KD降低至25KD，电泳条带下移，证明带有myc和His标签的重组hCREG蛋白为糖基化蛋白。 根据6×His与Ni亲合层析的原理用Ni-NTA纯化hCREG重组蛋白。收集的洗脱液经Centriprep离心超滤管（10000NMWL）浓缩后，经BCA法测定并与蛋白标准曲线比较，重组hCREG蛋白浓度为1.6mg/mL。考马斯亮兰染色可见30KD大小的较单一条带，经image-J软件分析，纯度为92％。浓缩并脱盐后的纯化蛋白经PNGaseF处理后分子量由30KD降至25KD，条带下移，证实纯化后的蛋白仍保留了糖基化形式。 流式细胞仪细胞周期分析结果提示重组hCREG蛋白与对照组相比可抑制体外培养的HITASY细胞增殖，G0/G1期细胞比率（共计数2万个细胞）显著增加，且低浓度组的抑制效应要高于高浓度组。BrdU掺入实验结果提示，添加2μg/mL重组hCREG蛋白组与对照组相比可显著抑制体外培养的HITASY细胞增殖，BrdU阳性细胞的比率降低。组间比较有统计学差异（P<0.05）。 结论：pcDNA3.1myc-His/hCREG真核表达载体的构建及具有生物学功能的重组hCREG/myc-His糖蛋白的表达纯化，为hCREG蛋白的功能研究及生物工程制备提供了实验平台。纯化的重组hCREG蛋白可能作为一种新的药物涂于支架表面，通过其促进分化、抑制增殖的生物学功能实现降低支架内再狭窄的作用。