工业菌株中β-葡萄糖苷酶表达优化及其UPR响应研究

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酿酒酵母是大规模酒精工业生产用菌种,当前它又发展成为日益重要的生物医药产品和酶制剂的生产平台。而对酿酒酵母进行的各种遗传改造和利用,都离不开蛋白质的表达与调控。本工作研究木质纤维素酶解和利用中最重要的组分之一β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase)基因在工业酵母单倍体衍生菌株An-α(MATαura3)中的锚定和分泌表达及相应的UPR信号响应规律,为最终实现β-glucosidase的高宿主兼容性、高水平、高锚定或高分泌效率表达奠定基础。具体内容如下:1、构建得到gRNA表达载体pRS42H-g LEU2、pRS42H-g HIS1,PCR方法制备了分别靶向基因LEU2、HIS1和LEU2的三个donor DNA片段,醋酸锂法共转化gRNA表达载体和donor DNA片段到An-α感受态细胞中,筛选、鉴定得到三个菌株:An-α(leu2)、An-α(leu2 his1)和An-α(leu2::UPRE-LacZ),从而初步建立了一套适用于工业菌株An-α的完整的CRISPR/Cas9基因编辑技术流程,得到分别携带有两个、三个营养缺陷型选择标记和UPR压力报告基因的平台菌株;2、在实验室现有β-葡萄糖苷酶BGLI高拷贝分泌表达载体YEplac195-Aa BGL和锚定表达质粒YEplac195-Aa BGL-cwp基础上,通过PCR和无缝重组连接,将启动子Ptpi和分泌肽xyn2s编码序列,更换为细胞壁蛋白Sed1p的启动子Psed1p和分泌肽Ssed1p编码序列,构建得到YEplac195-PSsed1-Aa BGL和YEplac195-PSsed1-Aa BGL-cwp;四个质粒引入菌株An-α(leu2::UPRE-LacZ)后在2%纤维二糖培养基中的对比评价显示:PSsed1使得分泌表达菌株的胞外β-葡萄糖苷酶酶活比例提高了20.12%(24 h)和8.57%(48 h),对锚定表达菌株的细胞酶活比例基本没有影响,而使两类菌株的总酶活值下降;LacZ酶活水平整体上与β-葡萄糖苷酶酶活水平呈正相关;3、按“1”中建立的方法构建了Yapsin蛋白酶编码基因YPS1和YPS2失活的UPR响应指示菌株An-α(leu2::UPRE-LacZ)(yps1)和An-α(leu2::UPRE-LacZ)(yps2),分别简写为AαL(yps1)和AαL(yps2);YPD液体培养基中的生长评价初步显示其生长与亲本菌株没有明显区别;导入质粒YEplac195-Aa BGL和YEplac195-Aa BGL-cwp后在2%纤维二糖培养基中的对比评价显示:YPS1和YPS2失活明显提高了表达的β-葡萄糖苷酶酶活、促进了菌株利用纤维二糖的生长,也不同程度提高了锚定表达时的锚定比例和分泌表达时的分泌比例:AαL(yps1)(BG-cwp)和AαL(yps2)(BG-cwp)的38 h酶活值,分别为对照菌株AαL(BG-cwp)38 h酶活值的2.077倍、1.731倍,锚定比例则分别上升2.50%、3.11%;AαL(yps1)(BG)和AαL(yps2)(BG)的38 h酶活值,分别为对照菌株AαL(BG)38 h酶活值的2.268倍、1.778倍,分泌比例则分别上升19.4%、22.2%;β-葡萄糖苷酶酶活水平与β-半乳糖苷酶酶活水平所代表的UPR信号响应值呈现出良好的相关性。
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