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DL-丙氨酸是用于合成作手性药物和农药的一种重要原料,也应用于食品添加剂和一些化妆品中。近些年来,DL-丙氨酸的需求量很大。目前,DL-丙氨酸制备方法主要为化学法和微生物发酵法,而在体外使用酶法制备DL-丙氨酸的研究鲜有报道。丙氨酸消旋酶(Alanine racemase,Alr)广泛存在于原核生物和部分真核生物中,但是人体中没有丙氨酸消旋酶。丙氨酸消旋酶属于5’-磷酸吡哆醛(pyridoxal 5’-phosphate,PLP)依赖型酶,具有催化L-丙氨酸转化为D-丙氨酸和催化D-丙氨酸转化为L-丙氨酸的功能。在本实验中,我们将大肠杆菌K-12的丙氨酸消旋酶Alr基因通过载体质粒pET-28a克隆到大肠杆菌BL21(DE3)中。重组大肠杆菌BL21-pET28a-Alr在LB或者M9液体培养基中经过异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)或者乳糖诱导后高表达出重组丙氨酸消旋酶。大肠杆菌K-12的Alr基因全长1080bp,编码359个氨基酸,蛋白分子量约为39kDa。1mg重组丙氨酸消旋酶需要辅酶磷酸吡哆醛0.025mg,丙氨酸消旋酶的最适pH和温度分别为9.0和37℃,丙氨酸消旋酶的酶活为1.35×10-4U。低于20.0mM的Mg2+对丙氨酸消旋酶的活性几乎没有影响,但是5.0mM的Fe2+和10.0mM的Mrn2+可以使丙氨酸消旋酶完全失去活性。在1L水溶液中,5mg重组丙氨酸消旋酶和0.125mg辅酶磷酸吡哆醛可在约24小时内将100gL-丙氨酸消旋生成DL-丙氨酸,反应液的旋光值从+0.243降为0。减压蒸馏结晶后,可以得到90.6gDL-丙氨酸,回收率为90.6%,相对标准偏差(RSD)为1.72%,旋光值为0。总之,最终可从1L重组大肠杆菌的培养液中纯化得到约23mg高活性的可用于制备约500gDL-丙氨酸的重组丙氨酸消旋酶。这种制备DL-丙氨酸的方法成本低,简单易操作,且污染小,可以应用于工业化生产。