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研究背景和目的：
角膜新生血管(corneal neovascularization，CNV)的形成常导致眼部正常结构破坏和功能的紊乱，甚至造成严重的视功能损害。本研究拟用rAAV1载体携带内皮抑素基因转染角膜基质细胞和ECV304细胞，来抑制角膜新生血管增生。因此，展开以下研究：(1)利用rAAV1载体携带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因转染原代培养的角膜基质细胞、人脐静脉内皮细胞(ECV304细胞)株；检测rAAV1的转染率。(2)单纯和联合采用结膜下注射rAAV1-EGFP转染液或转染液局部浸泡角膜的途径转移基因，通过整体荧光体视镜和激光共聚焦显微镜的观察、监测rAAV1-EGFP在活体动物模型中角膜上的表达，验证此转染途径的有效性。(3)以rAAV1携带的人内皮抑素(ES)基因导入角膜基质细胞和ECV304细胞中；分析转染rAAV1-ES后细胞中ES蛋白表达、分泌及对ECV304细胞和角膜基质细胞增殖的影响。(4)建立炎性大鼠CNV的动物模型，观察单独和联合使用转染液rAAV1-ES结膜下注射及局部浸泡去上皮角膜途径转染rAAV1-ES对角膜新生血管增生的抑制作用。
本研究目的是为基因转染角膜选择具有广泛应用前景的病毒载体；为转基因治疗角膜新生血管病变提供简便的、更有效的转染途径。
方法：
1.细胞培养
采用组织块培养法培养原代大鼠角膜基质细胞。取6只SD大鼠角膜，刮去角膜上皮层，分离外周组织，自角膜缘剪下1-2mm宽的角膜组织条。用PBS液清洗，刮去后弹力层及内皮层，加入适量20mL/L蛋白酶溶液，放入37℃，50mL/LCO2孵箱中50min。用PBS液清洗，把漂洗干净的基质剪切成约1mm×1mm×0.4mm的小块接种于培养瓶，加入DMEM培养基(含100mL/LFBS)，在37℃，50mL/LCO2饱和湿度培养箱中培养。以后每3～5d换培养基，连续培养3周。
2.细胞转染
将大鼠角膜基质细胞和ECV304细胞、BHK细胞分别接种于数个24孔板12h，rAAV1-EGFP和rAAV1-ES转染液分别按转染复数(multiplicitiesofinfection，MOI)5×103，5×104，5×105vg/cell进行转染。未进行病毒转染的细胞(MOI=0)作为阴性对照，各设6个复孔，DMEM培养基适量稀释，使其能够完全覆盖细胞培养面积，37℃孵育4h后，保留转染液，补充含100mL/L胎牛血清的DMEM培养基，继续培养。分别于转染后第2、3、4d收集被不同MOI转染的细胞上清。
3.体外基因表达的测定
1)EGFP基因表达的测定
角膜基质细胞和ECV304细胞分别以转染复数(MOI)5×103，5×104，5×105v.g/cell的rAAV1-EGFP进行转染。未进行病毒转染的细胞(MOI=0)作为阴性对照，转染后第7d，吸出培养液，PBS液清洗2遍，胰酶消化细胞，收集被不同MOI转染的细胞(2×105)，加入40mL/L多聚甲醛固定，用流式细胞仪检测各种细胞中EGFP表达的阳性率。
2)免疫印迹法(Westernblotting)检测ES基因的表达
Westernblotting检测：将ECV304、BHK-21细胞分别以1×106/孔的密度接种于6孔板，以rAAV1-ES(MOI=5×105v.g/cell)转染ECV304细胞和BHK-21细胞；以未转染的ECV304细胞作为对照组。转染4h后，保留转染液，补充含100mL/L胎牛血清的DMEM培养基继续培养96h。各取20μL细胞上清，电转膜至硝酸纤维素膜，50g/L脱脂奶粉室温下封闭1h。小鼠抗人ES单克隆抗体(工作浓度1:250)室温下孵育2h，PBS清洗3×10min，山羊抗小鼠IgG(二抗，HRP标志，工作浓度1:500)室温下孵育1h，DAB显色。
3)ELISA检测ES蛋白的分泌表达：
分别取rAAV1-ES转染后2、3和4d收集的细胞上清浓缩液，用ESELISAkit.试剂盒依照说明书进行检测。
4)MTT法检测细胞增殖
将大鼠角膜基质细胞和ECV304细胞分别接种于96孔板。培养12h后，rAAV1-EGFP和rAAV1-ES转染液分别按转染复数(multiplicitiesofinfection，MOI)5×103，5×104，5×105v.g/cell进行转染，以未进行病毒转染的细胞作为对照。各设6个复孔，DMEM培养基适量稀释转染液，使其能够完全覆盖细胞培养面积，37℃孵育4h后，保留转染液，补充含100mL/L胎牛血清的DMEM培养基，培养72h、96h后，分别加入5mg/mL的MTT10μL，继续培养4h，加入100μL二甲基亚砜(DMSO)终止反应，酶标仪读取A570值。
5)流式细胞仪分析细胞周期
以rAAV1-EGFP和rAAV1-ES(MOI=5×105v.g/cell)分别转染ECV304细胞，未进行病毒转染的细胞作为阴性对照。各设3个复孔，转染后72h，消化、收集细胞，用75％乙醇于4℃下固定18h，1000r×5min离心、PBS清洗。加入RNA酶100μL室温下振荡30min。然后加入碘化丙锭(propidiumiodide，PI)400μL，4℃染色30min。以流式细胞仪分析转基因对细胞周期的影响。
5.rAAV1-EGFP的体内转染
SD大鼠32只，每只任选一眼制作rAAV1-EGFP转染角膜的模型；按随机数字表法随机分为A、B、C、D四组。A组：上方近角膜缘处结膜下注射50μLrAAV1-EGFP转染液(病毒颗粒滴度为2×1010v.g/mL)：B组：刮除角膜上皮后，使角膜浸泡在rAAV1-EGFP(滴度为2×1010v.g/mL)转染液内10min；C组：刮除角膜上皮后，使角膜浸泡在rAAV1-EGFP(滴度为2×1010v.g/ml)转染液内10min并在同样部位结膜下注射50μLrAAV1-EGFP转染液(病毒颗粒滴度为2×1010v.g/mL)；D组：同样部位结膜下注射50μL生理盐水。
6.EGFP角膜组织表达的检测
转染后借助整体荧光体视镜实时、活体观察大鼠角膜上GFP的表达情况；7d处死大鼠，摘取眼球冷藏于OCT，用冰冻切片机将其切成7微米的薄片，在激光共聚焦显微镜下观察大鼠角膜组织各层绿色荧光蛋白的表达情况。
7.炎性角膜新生血管的抑制
在64只雄性SD大鼠中，每只任选一眼制作炎性大鼠角膜新生血管模型，以另眼为对照。显微镜下用10-0尼龙缝线分别穿过角膜基质层间断缝合3针(分别在11点、12点和1点3个钟点位置)，从距离角膜缘1.5mm(圆规定位)处向瞳孔中心方向进针。采用缝线法诱导大鼠产生较均匀的炎性角膜新生血管。
将64只大鼠随机分为A、B、C、D四组。A组：缝线后立即于上方近角膜缘处结膜下注射50μLrAAV1-ES转染液(病毒颗粒滴度为2×1010v.g/mL)；B组：刮除角膜上皮后，使角膜浸泡在rAAV1-ES(滴度为2×1010v.g/mL)转染液内10min；C组：缝线后刮除角膜上皮，使角膜浸泡在rAAV1-ES(滴度为2×1010v.g/mL)转染液内10min并在同样部位结膜下注射50μLrAAV1-ES转染液(病毒颗粒滴度2×1010v.g/mL)；D组：缝线后同样部位结膜下注射50μL生理盐水。
转染后在裂隙灯显微镜和外科显微镜监测新生血管反应。角膜新生血管面积计算是根据检测从角巩膜缘长出的新生血管的长度(l)和钟点数(C)。
分别在转染后4、7、14、21和28d各处死2只大鼠，摘取眼球，固定于多聚甲醛24小时；石蜡包埋切片。免疫组化检测角膜缘及角膜组织中ES基因的表达情况，HE染色于显微镜下检测角膜新生血管增生的密度。
结论：
1.rAAV1-EGFP能有效地转染大鼠角膜基质细胞(转染率49.13％)；更高效(转染率68.31％)转染ECV304细胞；而且对角膜基质细胞和ECV304细胞体外增殖无明显抑制作用。结果证实：在转基因治疗角膜新生血管中rAAV1是一种具有广泛应用前景的病毒载体。
2.采用单纯结膜下注射rAAV1-EGFP转染液或局部浸泡去上皮角膜的途径均可成功转导基因，但两种途径联合使用的效果更明显。此联合转染途径为转基因治疗角膜病变研究提供了简便的、更有效的转染途径。
3.采用在LT-9MACIMSYSPULS整体荧光体视镜下直接、无创的观察方式，进行活体细胞的实时定位监测rAAV1-EGFP在大鼠角膜上的表达。
4.ES的体外研究结果显示：rAAV1-ES转染ECV304细胞后有基因产物ES蛋白表达和分泌，并达到较高浓度(96.93ng/mL)。rAAV1-ES转染使ECV304细胞周期中G0/G1细胞比例明显增加，S期细胞比例显著减少；对其增殖具有较高效的抑制作用(抑制率54.54±1.37％)。但ES对角膜基质细胞无明显抑制作用。结果提示：ES对ECV304细胞增殖有选择性地、较高效的抑制作用。
5.通过转染液rAAV1-ES结膜下注射及局部浸泡去上皮角膜的转染途径可将ES基因有效转入大鼠缝线诱导的炎性CNV模型并抑制炎性CNV的增生；而且采用联合途径转基因能更有效地抑制缝线诱导的炎性CNV的增生(抑制率58.25％)。